مقالة منهجية

عزل الميتوكوندريا: تقنية لعزل الميتوكوندريا من عينة أنسجة سرطان المبيض البشري

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Zhan ، X. et al. تحضير الميتوكوندريا من أنسجة سرطان المبيض وأنسجة المبيض المراقبة لتحليل البروتينات الكمي. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو إجراء عزل الميتوكوندريا من أنسجة سرطان المبيض البشري باستخدام الطرد المركزي التفاضلي السرعة بالاشتراك مع الطرد المركزي المتدرج الكثافة. يمكن استخدام الميتوكوندريا المعزولة للتحليل البروتيني لسرطان المبيض البشري بروتين الميتوكوندريا.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الميتوكوندريا من أنسجة سرطان المبيض البشري

< p class = "jove_content" > تم استخدام عينات أنسجة المبيض بما في ذلك أنسجة سرطان المبيض (ن = 7) لهذا البروتوكول.

  1. تحضير 250 مل من المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا عن طريق خلط 210 ملي مولار مانيتول ، 70 ملي سكروز ، 100 ملي كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 50 ملي تريس حمض هيدروكلوريك ، 1 ملي مولار حمض رباعي الأسيتيك ديامين (EDTA) ، 0.1 ملي مولار إيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) ، 1 ملي مولار مثبط بروتياز فينيل ميثان سولفونيل (PMSF) ، 2 ملي مولار أورثوفانادات الصوديوم (V) ، و 0.2٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، الرقم الهيدروجيني 7.4.
  2. ضع ~ 1.5 جم من أنسجة سرطان المبيض في طبق زجاجي نظيف.
  3. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا المبرد مسبقا لغسل الدم برفق من سطح الأنسجة 3 مرات.
  4. استخدم مقص عيون نظيف لفرم الأنسجة بالكامل إلى حوالي 1 مم3 قطع ، ونقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
  5. أضف 13.5 مل من المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا الذي يحتوي على 0.2 مجم / مل ناجارس ، ثم استخدم الخالط الكهربائي لتجانس الأنسجة المفرومة (2 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
  6. أضف 3 مل أخرى من عازلة عزل الميتوكوندريا إلى متجانسات الأنسجة واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات.
  7. الطرد المركزي الأنسجة المحضرة متجانسة (1،300 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية). قم بإزالة الجزء النووي الخام (أي الحبيبات) واحتفظ بالمادة الطافية.
  8. الطرد المركزي للطافية (10,000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية). قم بإزالة الميكروسومات (أي المادة الطافية) واحتفظ بالحبيبات.
  9. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا وأعد تعليق الحبيبات جيدا عن طريق سحب العينة الخفيف.
  10. جهاز الطرد المركزي لتعليق الحبيبات (7,000 × جم ، 10 دقائق ، 4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية واحتفظ بالميتوكوندريا الخام (أي الحبيبات).
  11. أضف 12 مل من وسط التدرج الكثافة بنسبة 25٪ (أي Nycodenz) لإعادة تعليق الميتوكوندريا الخام المستخرجة.
  12. قم بعمل تدرج كثافة متقطع عن طريق ملء أنبوب من الأسفل إلى الأعلى ب 5 مل من 34٪ ، و 8 مل من 30٪ ، و 12 مل من 25٪ (تحتوي على الميتوكوندريا الخام من الخطوة 1.11) ، و 8 مل من 23٪ ، و 3 مل من وسط التدرج الكثافة 20٪ ، وقم بالطرد المركزي (52،000 × جم ، 90 دقيقة ، 4 درجات مئوية).
  13. استخدم حقنة طويلة وغير حادة لتجميع الميتوكوندريا المنقاة عند الواجهة بين وسط التدرج الكثافة 25٪ و 30٪ في أنبوب نظيف.
  14. أضف المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا إلى الميتوكوندريا المجمعة لتخفيفها إلى حجم ثلاثة أضعاف. جهاز طرد مركزي (15,000 × جم ، 20 دقيقة ، 4 درجات مئوية) وتخلص من المادة الطافية.
  15. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لعزل الميتوكوندريا لإعادة تعليق الحبيبات وأجهزة الطرد المركزي (15,000 × جم ، 20 دقيقة ، 4 درجات مئوية). تخلص من المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات.
  16. اجمع الحبيبات النهائية (أي الميتوكوندريا المنقاة) وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية < br / > ملاحظه: اجمع بين جميع الميتوكوندريا النقية من أنسجة سرطان المبيض كعينة من الميتوكوندريا لتحليل البروتينات الكمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حمض رباعي الأسيتيك ديامين (EDTA) سيغما 798681-100 جرام لا مائي، يتدفق بحرية، Redi-Dri، ≥98٪ DTT سيغما 10197777001 1،4-ديثيوثريتو إيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل إيثر) حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) سيغما E0396-10G بيوإكسترا ، ≥97.0٪ الخالط صامتة شيك HYQ-3110 جهاز طرد مركزي فائق السرعة بدرجة حرارة منخفضة إيبندورف 5424 ص الطرد المركزي شيانغ يي TDZ4 - WS مانيتول ماكلين M813424-100 جرام المانيتول هو بوليول (كحول متعدد الهيدراتيك) ينتج من الهدرجة من الفركتوز الذي يعمل كعامل تحلية ومرطب ويستكثر. لديها رطوبة منخفضة وضعف الملاءة النفطية. مثبط البروتياز فينيل ميثان سولفونيل فلوريد (PMSF) سولاربيو P0100-1 مل PMSF هو مثبط للبروتياز يتفاعل مع بقايا السيرين لتثبيط التربسين والكيموتريبسين والثرومبين والغراء. كلوريد البوتاسيوم ماكلين P816354-25 جرام كلوريد البوتاسيوم ، KCI ، المعروف أيضا باسم موريات البوتاسيوم والسيلفيت ، هو مادة صلبة بلورية عديمة اللون ذات طعم مالح يذوب عند 776 درجة مئوية (1420 درجة فهرنهايت). إنه قابل للذوبان في الماء ، ولكنه غير قابل للذوبان في الكحول. يستخدم كلوريد البوتاسيوم في الأسمدة والمستحضرات الصيدلانية والتصوير الفوتوغرافي وكبديل للملح

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة