نمذجة نموذج سرطان بطانة الرحم النقيلي: تقنية لتوليد سرطان بطانة الرحم مع ورم خبيث في العقدة الليمفاوية في نماذج الأرانب

الملخص

المصدر: Lauren Philp et al. نموذج سرطان بطانة الرحم تقويم العظام مع اعتلال العقد اللمفية خلف الصفاق المصنوع من خلايا VX2 المنتشرة والمزروعة في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو توليد نموذج أرنب لسرطان بطانة الرحم عن طريق حقن معلق خلية VX2 شديد النقائل في قرون الرحم المخيطة للأرنب. هذا يؤدي إلى توليد سرطان بطانة الرحم الأولي مع نقائل العقدة الليمفاوية خلف الصفاق.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. إنشاء خط خلية VX2 في المختبر

1. حصاد ورم VX2 من عضلة الفخذ والأرانب والنمو في جناح الفأر.
   1. قم بإذابة كتل الورم VX2 المجمدة (1 سم × 1 سم) ، وفرم على صفيحة مزرعة باستخدام شفرة مشرط وتصفى من خلال مرشح 70 ميكرومتر عن طريق إضافة كميات صغيرة من محلول الملح المتوازن هانكس (HBSS) بالتتابع لضمان توتر جميع الخلايا للحصول على حجم نهائي يبلغ 1 مل.
   2. عد الخلايا وتخفيفها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.9٪ بتركيز 1 × 10⁷ / مل وضعها على الثلج في أنبوب معقم.
      ملاحظه: تم الحصول على كتل الورم من متعاون في المختبر من الانتشار السابق لأورام VX2 في عضلات الفخذ الأرانب.
   قم
   3. بتخدير أنثى أرنب نيوزيلندي أبيض (وزن 2.5-3.5 كجم) باستنشاق 2-5٪ من الأيزوفلوران ، وإزالة الفراء المغطى بموقع الحقن وتطهير موقع الحقن بمحلول بوفيدون اليود. حقن 500 ميكرولتر من معلق خلية VX2 المحضر (5 × 10⁶ خلايا / مل) في عضلة الفخذ للأرنب. راقب الأرنب سريريا بحثا عن نمو الورم بدءا من اليوم 10.
   4. قتل الأرانب بعد أن يصل قطر الأورام إلى 1-1.5 سم (تقاس خارجيا بالفرجار) باستخدام طريقة معتمدة من الطبيب البيطري. تأكد من القتل الرحيم عن طريق التحقق من العلامات الحيوية بما في ذلك معدل ضربات القلب ومعدل التنفس. استئصال الورم باستخدام أدوات معقمة بعد تنظيف المنطقة بمحلول البيتادين.
   5. في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام أدوات معقمة ، قم بفرم الورم إلى قطع صغيرة (0.2 سم) على طبق زراعة أنسجة بطول 10 سم باستخدام شفرة مشرط. مرر شظايا الورم عبر مصفاة خلية 70 ميكرومتر باستخدام 1 مل من HBSS كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. عد الخلايا وتخفيفها باستخدام محلول ملحي 0.9٪ للحصول على 7.5 × 10⁵ خلايا في 200 ميكرولتر.
   6. تخدير ذكور NOD SCID فئران جاما (الوزن 25 جم) باستخدام 4٪ إيزوفلوران عند 1 لتر / دقيقة والحفاظ على التخدير باستخدام 2٪ إيزوفلوران. بمجرد تخدير الفئران ، قم بحقن 200 ميكرولتر من المحلول من الخطوة 1.1.5 في الأنسجة تحت الجلد لجناح الفأر باستخدام إبرة قياس 27.
2. حصاد ومرور خلايا VX2 في المختبر
   1. راقب نمو الطعم الغريب سريريا مرتين أسبوعيا حتى يصل قطر الأورام إلى 1 سم باستخدام الفرجار.
   2. قتل الفئران عن طريق وضعها في غرفة ثاني أكسيد الكربون₂ أو إجراء خلع عنق الرحم بعد التخدير بغاز إيزوفلوران بنسبة 4٪. استئصال الأورام في ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية.
   3. قم بفرم الأورام بمشرط إلى قطع 1-2 مم في طبق زراعة أنسجة بحجم 6 سم يحتوي على 3 مل من وسط النسر المعدل (DMEM) / Ham'ss F12 + 10٪ من وسط النسر الجنيني (FBS).
   4. اترك شظايا الورم دون إزعاج في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة يومين حتى تبدأ الخلايا في النمو من قطع الورم. بعد ذلك ، افحص الألواح المستنبتة يوميا عن طريق المجهر الضوئي بحثا عن التقاء الخلايا. عند الوصول إلى التقاء 70٪ ، قم بإضافة 1 مل من 0.05٪ تربسين إلى القارورة ووضعها مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   5. قم بتحييد التربسين باستخدام 6 مل من DMEM / Ham's F12 + 10٪ FBS ، واجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 3.5 مل من وسائط DMEM/Ham's F12 الجديدة + 10٪ FBS. أطباق مطلية بالكولاجين الطازج مقاس 6 سم مع 1.6 × 10⁶ خلايا لكل طبق لتحقيق ما يقرب من 50٪ من كثافة بذر الخلايا.
      ملاحظة: تشير كثافة الخلية بنسبة 50٪ إلى الخلايا التي تشغل 50٪ من مساحة سطح اللوحة عند توصيلها.
   6. المرور المبكر: كرر العملية المذكورة أعلاه (التربسيني ، البذر) حتى يتم تمرير الخلايا 5 مرات ثم قم بتقييم نقاء خط الخلية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتمييز الحمض النووي الجيني للأرانب عن الحمض النووي الجيني للفأر (انظر الخطوة 1.3.1-1.3.4).
      ملاحظه: بعد 8 مقاطع ، يمكن نشر الخلايا على ألواح زراعة الأنسجة العادية غير المغلفة بالكولاجين.
   7. تمرير وتربسينات وتجميد حصص الخلايا في DMEM / HAM F12 + 30٪ FBS + 10٪ DMSO بتركيز 2 × 10⁶ لكل قارورة. قم بتخزين الخلايا في النيتروجين السائل حتى تكون مطلوبة للتجارب.
3. تأكيد أصل VX2 للخلايا الباقية:
   1. قم بإنشاء علاج قياسي من الحمض النووي الجيني للفأر والأرانب المنقى (الخطوة 1.3.2 والخطوة 1.3.3). استخدم الاشعال التي تستهدف التسلسلات الخاصة بالأنواع ضمن إطار القراءة المفتوح الثاني لعنصر الينقولات الرجعية LINE-1.
      ملاحظه: التسلسلات التمهيدية ل CRPV E6 هي: 5's- GATCCTGGACCCAACCAGTGو 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. تم استخدام عناصر الينقولات الرجعية LINE-1. التسلسلات التمهيدية للأرانب LINE-1 هي: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC و 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT تسلسلات التمهيدي للماوس LINE-1 هي: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG و 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
   2. لإنشاء منحنى قياسي ل CRPV E6 ، قم بتنقية محللة الخلايا السرطانية VX2 (الخطوة 1.1.1) باستخدام مجموعة تجارية تتبع بروتوكول الشركة المصنعة. حدد كمية هذا الحمض النووي باستخدام مقايسة تجارية. قم بإجراء 6 تخفيفات تسلسلية من 225 بيكوغرام / ميكرولتر إلى 0.925 بيكوغرام / ميكرولتر في مخزن مؤقت منخفض EDTA-TE. لإنشاء منحنى قياسي للحمض النووي الجيني للفأر ، قم بتخفيف 100 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني التجاري للفأر في مخزن مؤقت منخفض EDTA-TE في 5 تخفيفات من 125 بيكوغرام / ميكرولتر إلى 0.0125 بيكوغرام / ميكرولتر.
   3. ضع 4 ميكرولتر من كل محلول مخفف من العينات من الخطوة 1.3.2 في الآبار وقم بتشغيل العينات في جهاز تدوير حراري PCR. استخدم قيم Cq من كل تشغيل جنبا إلى جنب مع كميات الحمض النووي لكل بئر لحساب منحنى قياسي باستخدام إعدادات العتبة التلقائية لبرنامج thermocycler.
   4. استخدم إجراءات qPCR القياسية لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل مع 40 دورة من التدوير بخطوتين (98 درجة مئوية و 60 درجة مئوية) على الدراجة الحرارية. حدد قيم العتبة ، وقم بتعيين قيم دلتا Ct عند >35 لضمان وجود الحد الأدنى من تلوث الفأر في خط خلايا الأرنب VX2. كان الحجم الإجمالي لكل تفاعل 10 ميكرولتر ، يتكون من 5 ميكرولتر من 2x Mastermix ، و 1 ميكرولتر من البادئات الأمامية + العكسية مع تركيز التمهيدي النهائي في التفاعل عند 250 نانومتر ، و 4 ميكرولتر من عينة الحمض النووي.
      ملاحظه: يتم تحديد قيم العتبة ، ويتم تعيين قيم دلتا Ct على >35 لضمان وجود الحد الأدنى من تلوث الماوس في خط خلية الأرنب VX2. المستوى الموصى به من VX2 DNA للكشف الموثوق به بواسطة qPCR هو 1-10 pg.

فئة

2. ثقافة خلايا VX2 وإنشاء تعليق الخلية

1. قم بإذابة القوارير التي تحتوي على خلايا VX2 (المجمدة في الخطوة 1.2.7) في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ونقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي مع 10 مل من وسط المزرعة (1: 1 DMEM / F-12 + 10٪ FBS و 1٪ بنسلين ستربتومايسين). جهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 107 × جم ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية في 9 مل من الوسائط.
2. نقل الخلايا المعلقة المعاد تعليقها إلى قارورة ثقافة كبيرة. احتضان الخلايا دون اهتزاز عند 37 درجة مئوية. افحص الخلايا يوميا بحثا عن التقاء باستخدام الفحص المجهري الضوئي وقم بتغيير وسائط المزرعة كل ثلاثة أيام.
3. إنشاء معلق خلية VX2 مزروع للحقن
   1. قم بإضافة 3 مل من 0.25٪ من التربسين إلى قارورة بمجرد وصول الخلايا إلى 80٪ من التقاء. ضع القارورة في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق. انقل المحلول إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي الشكل وجهاز طرد مركزي لمدة 8 دقائق عند 107 × جم ثم قم بإزالة المادة الطافية.
   2. اغسل كريات الخلية 3 مرات ب 9 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات وجهاز طرد مركزي وإزالة المادة الطافية على النحو الوارد أعلاه. عد الخلايا وقم بتخفيفها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.9٪ بتركيز 4 × 10⁷ خلايا / مل وضعها في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم على الجليد.
4. إنشاء تعليق خلية VX2 المنتشر في الجسم الحي للحقن
   1. قم بإذابة كتل الورم VX2 المجمدة (1 سم × 1 سم) ، وفرم على صفيحة مزرعة باستخدام شفرة مشرط وتصفى من خلال مرشح 70 ميكرومتر كما في الخطوة 1.1.1. أضف كميات صغيرة من HBSS بالتتابع لضمان إجهاد جميع الخلايا للحصول على حجم نهائي يبلغ 1 مل. عد الخلايا وتخفيفها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات بنسبة 0.9٪ إلى تركيز 1 × 10⁷ / مل وضعها على الثلج في أنبوب معقم.
      ملاحظه: تم الحصول على كتل الورم من متعاون في المختبر من الانتشار السابق لأورام VX2 في عضلات الفخذ الأرانب.

فئة < ص = "jove_title" >3. إنشاء النموذج الجراحي

1. إنشاء التخدير الجراحي والتحضير قبل الجراحة
   العلاج
   1. المسبق للإناث الأرانب النيوزيلندية البيضاء (2.5-3.5 كجم) قبل ساعة واحدة من الإجراء الجراحي المخطط له باستخدام حقن الأسيبرومازين (1 مجم / كجم عضلي) وميلوكسيكام (0.2 مجم / كجم مربع). تخدير أنثى أرنب نيوزيلندي أبيض (وزن 2.5-3.5 كجم) مع 2-5٪ من الأيزوفلوران المستنشق ، وإزالة الفراء المغطى بموقع الحقن وتطهير موقع الحقن بمحلول بوفيدون اليود.
   2. قم بتنبيب الأرانب المخدرة باستخدام مجرى الهواء لقناع الحنجرة (LMA) وثبته في مكانه بشريط لاصق ، مع الحفاظ على التخدير العميق عن طريق معايرة جرعة الأيزوفلوران المستنشقة بين 2-5٪. راقب التخدير الجراحي بانتظام طوال العملية عن طريق فحص العلامات الحيوية (معدل التنفس ، إعادة ملء الشعيرات الدموية ، تشبع الأكسجين إن وجد) ومراقبة العلامات التي توحي بالألم (الحركة ، الانسحاب من المحفزات ، الضوضاء) أو التخدير الخفيف (الحركة ، مضغ أنبوب LMA).
      ملاحظه: يجب أن يتم ذلك من قبل شخص لديه خبرة في مراقبة التخدير الجراحي.
   3. ضع قسطرة وريد الأذن قياس 22 في الوريد الظهري الهامشي. يجب تطبيق سيفازولين (20 ملغ/كغ) عن طريق الوريد قبل 10 دقائق من شق الجلد الجراحي.
   4. قص الشعر على الحوض والبطن قبل وضع الأرنب على طاولة العمليات ، ثم ضع الأرانب في وضع ظهري على طاولة العمليات. نظف المجال الجراحي باستخدام تحضير جراحي للجلد من 3 خطوات (صابون البيتادين ، محلول الكلورهيكسيدين ، محلول البيتادين). ثنى المجال الجراحي بستائر شق البطن بعد وضع علامات على الجزء العلوي من عظم العانة ، مع ترك مساحة 5 سم × 5 سم من أسفل البطن مكشوفة.
2. إنشاء شق شق البطن وتحديد قرون الرحم
   1. ارتد قبعة جراحية وقناع للوجه. افرك اليدين باستخدام محلول التقشير الجراحي الكلورهيكسيدين أو البيتادين. باستخدام تقنية معقمة ، ارتد ثوبا معقما وقفازات جراحية معقمة.
   2. باستخدام مشرط # 11 شفرة ، قم بعمل شق بطول 2.5 سم في الجمجمة بطول 1 سم في ارتفاق العانة من خلال الجلد والأنسجة تحت الجلد لبطن الأرنب. شق اللفافة المستقيمة وتشريح عضلات المستقيم بشكل جانبي لكشف الصفاق الأساسي. أدخل الصفاق بشكل حاد بعد التأكد من أن السطح السفلي خال من الأمعاء أو أعضاء البطن الأخرى.
   3. حدد موقع قرون الرحم التي تحدد المثانة البولية ومسح إصبع مرتدي القفاز بشكل متفوق وخلفي وجانبي فوق قمة المثانة.
      ملاحظه: إذا لزم الأمر ، يمكن إفراغ المثانة الكاملة باستخدام الضغط الرقمي. بمجرد تحديد موقعها ، قم بإحضار قرون الرحم من خلال شق البطن لتستقر على جدار البطن.
   4. باستخدام خياطة قابلة للامتصاص مضفرة 3-0 ، قم بإجراء خياطة واحدة لكل قرن رحمي حوالي 1.5-2.0 سم بعيدا عن عنق الرحم. ضع الخيط في وسط الشرايين الرحمية ، والتي تمتد على طول الجانب الجانبي لكل قرن. اربط الغرز بإحكام لإغلاق قرون الرحم البعيدة (الشكل 1).
3. تلقيح VX2 العضلي
   1. باستخدام إبرة قياس 27 ، قم بحقن 0.5 مل من معلق خلية VX2 المعد مسبقا من الخطوة 2.3.2 (لنموذج VX2 المستنبت) أو 2.4 (لنموذج VX2 المنتشر في الجسم الحي) في عضل الرحم لكل قرن رحم قريب من موقع الخياطة (بين موقع الخياطة وعنق الرحم). حقن أكثر من 1 دقيقة وتأكد من عدم حقن الخلايا في تجويف الرحم الأساسي. تخدير باستخدام الأيزوفلوران المستنشق (2-5٪) وآلة التخدير بدائرة Bain.
   2. اضغط على موقع حقن عضل الرحم لمدة 30 ثانية بعد الحقن لتقليل تسرب الخلايا. افحص مواقع الحقن والخياطة بحثا عن الإرقاء وأعد قرون الرحم إلى البطن.
4. إغلاق الشق الجراحي
   1. إغلاق جدار البطن العميق: تحديد قمة الشق البريتوني وأمسك الصفاق والعضلة المستقيمة واللفافة باستخدام ملقط الأنسجة.
      1. للقيام بذلك ، قم بتثبيت الخيط في قمة واحدة من الشق عن طريق خياطة سطحية إلى عميقة على جانب واحد من الشق وعميقة إلى سطحية على الجانب الآخر. اربط عقدة. باستخدام الخيط المرفق ، اجعل غرز الجري متعامدة مع الشق من خلال طبقات جدار البطن تعمل خطوة بخطوة على طول الشق من جانب إلى آخر. اربط الخيط وقطعه.
   2. إغلاق جدار البطن السطحي: تحديد قمة شق الجلد وخياطة جلد البطن باستخدام خياطة متعددة الخيوط قابلة للامتصاص تحت الجلد 3-0. ضع الغراء الجراحي على الشق المغلق لمعارضة حواف الجلد.
      1. للقيام بذلك ، قم بتثبيت الخيط في قمة واحدة من الشق ، عن طريق خياطة عميقة إلى سطحية على جانب واحد من الشق والسطحية إلى العميقة على الجانب الآخر. اربط عقدة. باستخدام الغرز المرفقة ، قم بعمل غرز جارية في الطبقة الجلدية موازية للشق يعمل خطوة باتجاه على طول الشق من جانب إلى آخر. اربط الخيط وقطعه.
5. رعاية ما بعد الجراحة
   1. الاستيقاظ من التخدير: قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران بمجرد إغلاق الشق ودع الأرنب يتنفس الأكسجين بواسطة قناع أثناء مراقبة علامات الاستيقاظ (على سبيل المثال ، الحركات العفوية وفتح العين وحركات المضغ على مجرى الهواء القناع الحنجري). قم بإخراج الأرنب بمجرد ملاحظة هذه العلامات وتوفير الأكسجين بواسطة قناع وبطانية دافئة حتى تصبح الأرانب في حالة تأهب وقادرة على الجلوس بشكل مستقل.
   2. مراقبة ما بعد الجراحة: راقب الأرانب مرتين يوميا لمدة 4 أيام ويوميا لمدة 10 أيام إضافية بعد الجراحة. لمراقبة وتقييم حالتهم العامة ، وتناول الطعام والماء ، وإخراج البول والبراز ، وتقييم الألم ، والوزن ، والعلامات الحيوية (معدل ضربات القلب ، ومعدل التنفس) وموقع الجراحة بحثا عن التورم أو الحمامي أو الإفرازات أو تفكك
   .
   3. السيطرة على الألم بعد الجراحة: يتم تطبيق ميلوكسيكام يوميا (0.2 ملغ/كغ مربع) لمدة 48 ساعة بعد الجراحة ثم حسب الحاجة بناء على تقييم الألم. يتم تطبيق البوبرينورفين مباشرة بعد الجراحة وكل 12 ساعة (0.01-0.05 ملغ/كغ مربع) لمدة 24 ساعة ثم حسب الحاجة بناء على تقييم الألم
   .
   4. يمكن إعطاء المضادات الحيوية (إنروفلوكساسين 5 ملغ/كغ من الحقن العضلي) يوميا لمدة سبعة أيام بعد الجراحة لمنع عدوى الجرح على النحو الموصى به من قبل الطبيب البيطري. قم بإعطاء السوائل تحت الجلد (15 مل من المتر المربع) مرتين يوميا حسب الحاجة للجفاف ويتم توفير الأطعمة اللينة أو المكملات الغذائية الأخرى يوميا حسب الحاجة لفقدان الوزن.

النتائج

الشكل 1: خياطة الرحم. السهم الأسود = الغرز ، السهم الأحمر = قرون الرحم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مشرط 11 شفرة ، معقم ، يمكن التخلص منه أسبن الجرافيكل (VWR) 80094-086 قسطرة وريد الأذن 22-gague CDMV 14332 [م] 3-0 خياطة متعددة خيوط قابلة للامتصاص (Polysorb) كوفيديان 356718 3-0 خياطة قابلة للامتصاص مضفرة (Polysorb) كوفيديان 356718 مصفاة خلية 70uM ، ملفوفة بشكل فردي ، نايلون صقر هاتف: 352350 أسيبرومازين (أترافيت) CDMV 1047 صابون البيتادين (بوفيودون يود 7.5٪) CDMV 4363 محلول البيتادين (بوفيودون اليود 10٪) متاجر UHN 457955 بوبرينورفين جامعة ماكجيل سيفازولين صيدلية UHN للمرضى الداخليين لا قطة # مطلوبة محلول الكلورهيكسيدين CDMV 119872 Corning BioCoatCellware ، كولاجين من النوع الأول ، أطباق 100 مم كورنينج هاتف: 354450 العلامة التجارية ليست مهمة Corning BioCoatCellware، كولاجين من النوع I، 24 بئرا كورنينج 354408 العلامة التجارية ليست مهمة Corning BioCoatCellware، كولاجين من النوع I، أطباق 6 آبار كورنينج 354400 العلامة التجارية ليست مهمة مصفوفة غشاء القاعدية Corning Matrigel ، * خالية من LDEV ، 10 مل كورنينج 354234 DMEM / هام F12 1: 1 تقنيات الحياة هاتف 11320 العلامة التجارية ليست مهمة DMSO كاليدون لاب كيم 10/1/4100 إنروفلوكساسين (بايتريل عن طريق الحقن) CDMV هاتف: 11242 أنبوب الصقر كورنينج سنتري ستار 430828 مصل الأبقار الجنينية، مؤهل، من أصل كندي، 500 مل تقنيات الحياة 12483020 العلامة التجارية / المصدر غير مهم إيزوفلوران صيدلية UHN للمرضى الداخليين لا قطة # مطلوبة تباين إيسوهكسول جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 407141210 ميلوكسيكام (ميتاكام 0.5٪) CDMV 104674 محلول ملحي عادي ماركة البيت (UofT Medstore) 1011 برنامج تلفزيوني متعدد الخلايا أو سيجما 331-010-CL أو D8537-500mL البنسلين / الستربتومايسين (100 مل ؛ 10000 وحدة بنسلين ، 10000 ميكروغرام ستربتومايسين) كورنينج سيلجرو CA45000-652 محلول ملح متوازن معقم هانكس (-Ca ++ ، -Mg ++ ، -Phenol Red) T.C.M.F (دكتور بريستو) 28-يناير-11 الغراء الجراحي (لاصق الأنسجة) 3M فيتبوند 14695 ب التربسين (0.25٪) ، درجة البروتينات سيغما تي -6567-5X20UG تربسين EDTA ، 0.05٪ ، 100 مل شركة Wisent 325-542-EL العلامة التجارية ليست مهمة