تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. إعداد واحتضان الشريحة المعالجة ب ITO للزراعة المشتركة
- الثقافات المشتركة غير المقسمة
- قم بتسييل الاغاروز عند 70 درجة مئوية على طبق ساخن.
- ضع المقسم المكون من 8 آبار فوق الشريحة المعالجة بقصدير الإنديوم (ITO) (الشكل 1 أ). يساعد الجزء السفلي المطاطي الموجود على الحاجز في الالتصاق بالشريحة ، ولكن تأكد من تطبيق ضغط هبوطي لطيف مستمر أثناء طلاء الاغاروز لضمان عدم حدوث تسرب أو خلط بين الآبار.
- اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل ، وجهاز طرد مركزي (5 دقائق عند 800 دورة في الدقيقة) ، وأعد تعليقه إلى 50 ألف خلية لكل 150 ميكرولتر في وسائط DMEM 1x. إذا كانت كثافة الخلية المختلفة هي المثلى ، فتأكد من أن تعليق الخلية في هذه الخطوة هو 2x الكثافة النهائية المطلوبة (على سبيل المثال ، بالنسبة للتركيز النهائي ل 50,000 خلية في 300 ميكرولتر ، فإن كثافة الخلية في هذه الخطوة هي 50,000 خلية في 150 ميكرولتر).
- قبل طلاء زراعة الخلايا ، أضف نبتة المبيض إلى وسط البئر (الشكل 1 ب).
- أضف الاغاروز إلى كل مزرعة خلية في أنابيب فردية سعة 2 مل قبل الطلاء مباشرة. لكل بئر ، اجمع بين 200 ميكرولتر من تعليق الخلية و 200 ميكرولتر من الاغاروز المسال في أنبوب 2 مل. على سبيل المثال ، بالنسبة لأربعة آبار ، اجمع بين 800 ميكرولتر من تعليق الخلية و 800 ميكرولتر من 2٪ agarose. سيتم ترك بعض الخليط ولكن صنع أكثر بقليل من اللازم يتجنب فقاعات الهواء أثناء سحب العينات.
- أضف الاغاروز إلى مزارع الخلايا الفردية مباشرة قبل طلاء مزرعة الخلايا هذه. سوف يبرد الاغاروز في أقل من دقيقة ، لذا كن مستعدا للطبق بسرعة.
- أضف على الفور 300 ميكرولتر من خليط الخلية / الاغاروز إلى كل بئر (الشكل 1 ج). يوضح الشكل 1C ثلاث حالات خلوية وحالة وسائط واحدة ، كل منها مطلي بمبيض وبدونه.
- احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة.
- الثقافات المشتركة المنقسمة
- قطع الفواصل من البلاستيك الرقيق الناعم (الشكل 2 أ).
ملاحظه: تستخدم هذه التجربة جوانب حوض وسائط معقم يمكن التخلص منه لأنها مسطحة ورقيقة. قم بقصها على نطاق واسع بما يكفي لتناسب بشكل مريح في وتر البئر (~ 13 مم).
- قم بتسييل الاغاروز عند 70 درجة مئوية على طبق ساخن.
- ضع المقسم المكون من 8 آبار أعلى الشريحة المعالجة ب ITO (الشكل 2 ب). يساعد الجزء السفلي المطاطي الموجود على الحاجز في الالتصاق بالشريحة ، ولكن تأكد من تطبيق ضغط هبوطي لطيف مستمر أثناء طلاء الاغاروز لضمان عدم حدوث تسرب أو خلط بين الآبار.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. شريحة التجفيف والتحضير ل MALDI-TOF MS
- بعد أربعة أيام (أو أي نقطة زمنية مفضلة) ، قم بإزالة مقسم الغرفة من سدادات الاغاروز والشريحة (الشكل 1 د). افصل جوانب الاغاروز برفق عن الغرفة بملعقة مسطحة واسحب الغرفة برفق لأعلى ، مع الحرص على عدم تحريك أي سدادات الاغاروز. إذا تحركوا ، فأعد وضعهم برفق حتى لا يلمسوا بعضهم البعض.
- ضع الشريحة في فرن 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات تقريبا ، مع الدوران بزاوية 90 درجة كل ساعة.
ملاحظه: يعد دوران الشريحة مهما لضمان توزيع الحرارة بشكل متساو في جميع أنحاء العينة.
- بمجرد أن تجف ، أخرج الشريحة من الفرن (الشكل 1 ه).
- قم بتطبيق محلول المصفوفة باستخدام البخاخ (الشكل 1F) ، مع المعلمات التالية: درجة الحرارة = 30 درجة مئوية ، معدل التدفق = 0.2 مل / دقيقة ، عدد التمريرات = 8 ، الاتجاه = CC ، ومسافة الفوهة = 40 مم.
ملاحظه: بدلا من بخاخ المصفوفة ، يمكن استخدام البخاخة الفنية لتطبيق مصفوفة سائلة. يمكن استخدام نفس محلول المصفوفة للرش ، ولكن هناك حاجة إلى ما يقرب من ضعف كمية المحلول. مع تثبيت الشريحة بحيث تتدلى عموديا ، رش الشريحة بزاوية 90 درجة على بعد قدم واحدة تقريبا حتى تصبح طبقة المصفوفة مرئية.
- أضف 1 ميكرولتر من العيار (أحمر الفوسفور للأهداف <500 دالتون ، خليط ببتيد (انظر جدول المواد) للأهداف <5,000 دال) لمسح البقع على الشريحة. لا يتطلب الفوسفور الأحمر أي اختلاط مع المصفوفة ، لكن خليط الببتيد يتطلب خليطا 1: 1 مع المصفوفة للمساعدة في التأين. انتظر حتى يجف العيار.
- ارسم علامة X باستخدام علامة دائمة في كل ركن من أركان الشريحة والتقط صورة بصرية باستخدام كاميرا أو ماسح ضوئي بدقة 1,200 نقطة في البوصة.
