التصوير القائم على المسبار النانوي SERRS الوظيفي بالأجسام المضادة: تقنية تصوير رامان عالية الحساسية للكشف عن سرطان المبيض النقيلي في الجسم الحي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Andreou ، C. et al. قياس نسبة مسبار نانوي متفرق رامان بالرنين المعزز بالسطح للكشف عن سرطان المبيض المجهري عن طريق استهداف مستقبلات حمض الفوليك. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو تقنية تشتت رامان بالرنين المعزز بالسطح للكشف عن سرطان المبيض النقيلي باستخدام مجسات نانوية مستهدفة ، وأجسام مضادة محددة مضادة للمستقبلات ومجسات تحكم نانوية غير مستهدفة. تساعد هذه الطريقة في تحديد الوفرة النسبية للمجسات النانوية وتمييز الخلايا السرطانية عن الخلفية الحشوية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة < p = "jove_title" >1. توليف الذهب Nanostar الأساسية

ملاحظة: تستخدم النجوم النانوية الذهبية كنوى لكلتا النكهات من مجسات SERRS النانوية المستخدمة في هذه التجربة.

1. تحضير 800 مل من محلول حمض الأسكوربيك 60 ملي مولار (C₆H₈O₆) في الماء منزوع الأيونات (DI) و 8 مل من محلول حمض رباعي الكلورو أوريك 20 ملي مولار (HAuCl₄) في ماء DI. تبرد إلى 4 درجات مئوية.
2. قم بتنفيذ خطوة التفاعل هذه عند 4 درجات مئوية. ضع قارورة مخروطية تحتوي على 800 مل من محلول حمض الأسكوربيك على لوحة تحريك مغناطيسية وحث على دوامة ثابتة. أضف بسرعة 8 مل من محلول حمض رباعي كلورو أوريك إلى الدوامة. في غضون ثوان ، ستتشكل النجوم النانوية وسيفترض المحلول لونا أزرق داكن. إذا أصبح اللون في أي وقت ورديا أو أرجوانيا ، مما يدل على تكوين الكريات النانوية ، فيجب التخلص من التعليق وإعادة محاولة التوليف.
3. صب معلق nanostar في أنابيب مخروطية سعة 50 مل وأجهزة طرد مركزي لمدة 20 دقيقة (4 درجات مئوية ، 3,220 × جم). استنشق المادة الطافية تاركا ما يقرب من 200 ميكرولتر من المحلول في كل أنبوب. توخي الحذر حتى لا تزعج حبيبات الجسيمات النانوية في الجزء السفلي من الأنبوب.
   ملاحظه: يجب أن يكون للطافية صبغة زرقاء بسبب النجوم النانوية المعلقة المتبقية.
4. باستخدام ماصة دقيقة، قم بتحريك المحلول لتعليق وتجميع الجسيمات النانوية من كل أنبوب. قد يتم ضغط جزء من الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب ولن يتعلق حتى مع سحب العينات القوية - تخلص من هذا الجزء.
5. انقل تعليق الجسيمات النانوية إلى كاسيت غسيل الكلى (MWCO 3.5 كيلو دالتون) وقم بغسيل الكلى لمدة ثلاثة أيام على الأقل مقابل 2 لتر من ماء DI ، مع تغيير الماء يوميا. قم بتخزين النجوم النانوية في غسيل الكلى عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر مع تغيير الماء كل 3-4 أيام.
   ملاحظه: يجب الاحتفاظ بالنجوم النانوية في غسيل الكلى حتى تكون مطلوبة لتفاعل السيليكاشن ، كما هو موضح في القسم 2.

< p class = "jove_title" >2. تشكيل قشرة السيليكا

ملاحظة: يتم تصنيع نكهتين من مجسات رامان النانوية. إجراء التوليف هو نفسه لكليهما ، والفرق الوحيد هو جزيء رامان ريبورتر (الصبغة) المستخدم. في هذه التجربة ، يتم استخدام IR780 بيركلورات و IR140. يجب دائما إجراء التفاعل في حاويات بلاستيكية. التوليف قابل للتطوير بدرجة كبيرة ويمكن تعديله للكمية المطلوبة من الحقن المطلوبة. هنا ، يتم وصف تخليق الدفعات المتوسطة ، والذي يمكن تحجيمه خطيا إلى أحجام أقل أو أعلى حسب الحاجة ، بنفس التركيزات وأوقات التفاعل. يمكن إجراء التفاعلات لنوعي المسبار النانوي SERRS بالتوازي. انتبه لتجنب التلوث المتبادل. يجب إجراء صوتنة لإعادة تشتت كريات الجسيمات النانوية بعد الطرد المركزي أثناء خطوات الغسيل أو بعد تخزين الجسيمات النانوية لمدة تزيد عن ساعة واحدة. يجب إجراء صوتنة حتى يتم تعليق الجسيمات النانوية بوضوح في المحلول ، عادة لمدة 1 ثانية.

1. في الأنبوب A (أنبوب مخروطي سعة 50 مل) ، امزج 10 مل من الأيزوبروبانول ، و 500 ميكرولتر من TEOS ، و 200 ميكرولتر من ماء DI ، و 60 ميكرولتر من الصبغة (IR780 بيركلورات أو IR140 ، 20 ملي مولار في DMF (ثنائي ميثيل فورماميد)).
2. في الأنبوب B (أنبوب مخروطي 15 مل) ، امزج 3 مل من الإيثانول و 200 ميكرولتر من هيدروكسيد الأمونيوم. قم بتقطيع النجوم النانوية من الخطوة 1.4 لتفريق أي عناقيد في المحلول وإضافة 1.2 مل من النجوم النانوية إلى الأنبوب.
   ملاحظة: محلول هيدروكسيد الأمونيوم شديد التقلب ويصعب ماصته بدقة. قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية، لحين الحاجة، لتسهيل سحب العينات.
3. ضع الأنبوب A على خلاط دوامة وقم بتحفيز دوامة ثابتة. أضف محتويات الأنبوب B بسرعة إلى الدوامة واستمر في الخلط لمدة 5 ثوان تقريبا. انقله على الفور إلى شاكر واتركه يتفاعل لمدة 15 دقيقة أثناء الاهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة ، في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد الحضانة لمدة 15 دقيقة ، قم بإخماد التفاعل بإضافة الإيثانول لملء أنبوب 50 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 20 دقيقة عند 3,220 × جم و 4 درجات مئوية.
5. استنشق المادة الطافية ، مع ترك حوالي 0.5 مل من المحلول ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. أضف 1 مل من الإيثانول وحرك بماصة لإعادة تعليق الجسيمات النانوية. نقل إلى أنبوب طرد مركزي 1.5 مل واغسله 4 مرات بالإيثانول عن طريق الطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة 4 دقائق ، وشفط المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات عن طريق الموجات فوق الصوتية لمدة 1 ثانية تقريبا.
6. ملاحظة: في هذه المرحلة ، يمكن تشغيل الجسيمات النانوية ذات السيليكات ، كما هو موضح في القسم 3 ، أو إعادة تعليقها في ماء DI مع خطوة غسيل إضافية ، للتخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

فئة

3. وظائف السطح

ملاحظة: سيتم اقتران المجسات النانوية IR780 SERRS مع الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات حمض الفوليك عبر الرابط المتقاطع PEG لتشكيل αFR-NPs ؛ سيتم اقتران مجسات التحكم النانوية IR140 SERRS مع طبقة أحادية PEG تخميلة ، ل nt-NPs. تتشكل كلتا النكهتين عن طريق تفاعل الثيول ماليميد في تفاعلات منفصلة ولكن متوازية.

1. اغسل الجسيمات النانوية مرتين عن طريق الطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة 4 دقائق ، وشفط المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من الإيثانول عن طريق الموجات فوق الصوتية. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى ، ولكن أعد توزيعها في 1 مل من 85٪ إيثانول ، و 10٪ 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane) ، و 5٪ ماء DI. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1-2 ساعة لإدخال الثيول على سطح الجسيمات.
2. اغسل الجسيمات النانوية الوظيفية بالثيول عن طريق الطرد المركزي عند 11,000 × جم لمدة 4 دقائق ، وشفط المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات عن طريق الموجات فوق الصوتية ، مرتين في الإيثانول ، ومرتين في DI ، وأخيرا في HEPES (4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض المخزن المؤقت (10 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني 7.1) ، واتركه جانبا.
3. ملاحظة: يجب استخدام المخزن المؤقت MES (2- (N-morpholino) حمض الإيثان سلفونيك) أو HEPES. قد تؤدي المخازن المؤقتة ذات الملوحة العالية ، مثل PBS (المحلول الملحي المخزن بالفوسفات) ، إلى تراكم الجسيمات النانوية.
4. بالنسبة للجسم المضاد الوظيفي αFR-NPs ، تفاعل 200 ميكروغرام من الأجسام المضادة (استنساخ الأجسام المضادة للبروتين المرتبط بحمض الفوليك [LK26]) مع زيادة مولية بمقدار عشرة أضعاف من الوصلة المتشابكة PEG (بولي (إيثيلين جلايكول) (N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) الأثير N′- (3-maleimidopropionyl) أمينوإيثان (CAS: 851040-94-3) ، في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)) في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MES (10 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني 7.1) لمدة 30 دقيقة.
5. قم بإزالة الوصلة المتشابكة الزائدة والتركيز على الجسم المضاد عن طريق الطرد المركزي لمحلول الجسم المضاد PEG في مرشح الطرد المركزي (MWCO 100 kDa). بالنسبة لمرشحات الطرد المركزي المستخدمة في هذه الدراسة ، قم بإجراء الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 14,000 × جم و 23 درجة مئوية.
6. ماصة الجسيمات النانوية IR780 من الخطوة 3.2 إلى الأنبوب مع الأجسام المضادة وتحريكها باستخدام الماصة للخلط. احتضان الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل لتشكيل αFR-NPs.
7. لتشكيل nt-NPs ، أضف 1٪ وزن / حجم من الميثوكسي منتهي (م) PEG5000-ماليميد (CAS: 99126-64-4) المذاب في DMSO إلى الجسيمات النانوية IR140 SERRS من الخطوة 3.2 واتركها تتفاعل في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MES (10 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني 7.1) لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة ، أو عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
8. للإعطاء للفئران (القسم 4) ، قم بتدوير كل من نكهات المسبار النانوي عند 11,000 × جم لمدة 4 دقائق ، وشفط المادة الطافية لإزالة المحلول بأجسام مضادة حرة غير متفاعلة / PEG ، وأعد تشتيت كل نكهة في مخزن MES المؤقت (10 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.1) بتركيزات 600 جزء من المليون. عند إعادة تعليق الجسيمات النانوية ، قلل من التعرض غير الضروري للموجات فوق الصوتية لمنع تمسخ الجسم المضاد.

< p class = "jove_title" >4. حقن وتصوير مسبار النانو

1. قم بإعداد المجسات النانوية (αFR-NPs و nt-NPs) كما هو موضح في الأقسام 1-3 واخلطها بنسبة 1: 1 ، للتركيز النهائي 300 جزء من المليون من كل نوع في المخزن المؤقت MES (10 ملي مولار ، الرقم الهيدروجيني 7.1). اختياريا ، قم بإعداد معايير مرجعية تبلغ 30 جزءا من المليون من نكهات المسبار النانوي في أنابيب مخروطية صغيرة (100 ميكرولتر).
2. حقن 1 مل من تعليق الجسيمات النانوية داخل الصفاق في كل فأر وتدليك البطن برفق لتوزيع الجسيمات النانوية داخل التجويف البريتوني. أعد الماوس إلى غلافه. بعد 25 دقيقة أو أكثر ، قتل الفأر عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂.
3. اربط الماوس على منصة جراحية ، في وضع الاستلقاء (لتصوير البطن بالكامل ، يجب أن تكون المنصة قابلة للتركيب على مرحلة المجهر المستقيم).
   1. باستخدام ملقط مسنن ومقص تشريح ، قم بإزالة الجلد لكشف الصفاق وإجراء شق سهمي كبير (يتراوح طوله بين 2 و 3 سم) لكشف البطن بالكامل. نعلق اللوحات البريتونية على المنصة. اغسل الجزء الداخلي من التجويف البريتوني بما لا يقل عن 60 مل من PBS باستخدام زجاجة بخاخ بلاستيكية.
      ملاحظة: لتمكين التصوير دون عائق للبطن بالكامل ، يجب تعبئة الأمعاء أو استئصالها. للاستئصال ، قم بالاستئصال مع ربط الأوعية المساريقية لتقليل النزيف في تجويف البطن.
   2. بدلا من ذلك ، لتصوير أعضاء معينة ، قم باستئصالها بعد غسل PBS ، وضعها على شريحة مجهرية.
4. انقل المنصة أو الشريحة إلى مقياس الطيف الضوئي الدقيق رامان مع التكوين البصري المستقيم ومرحلة آلية للتصوير ؛ استخدم نظاما تجاريا مع ليزر 300 ميجاوات 785 نانومتر ، مع شبكة من 1,200 أخدود لكل مم ، متمركزة عند 1,115 سم ^-1.
   1. ركز على مجال الاهتمام باستخدام بصريات الضوء الأبيض ، parfocal مع ليزر رامان. حدد المنطقة المراد تصويرها والدقة المطلوبة ؛ في هذا التقرير تم استخدام أسلوب اكتساب عالي السرعة (الأطياف المكتسبة تحت إضاءة الليزر المستمرة مع مرحلة المجهر تتحرك باستمرار ، مع دقة مكانية فعالة 14.2 ميكرومتر × 200 ميكرومتر ؛ عند تكبير 5x ، طاقة 100 ميغاواط في الهدف ، و <100 مللي ثانية تعرض لكل نقطة).
      ملاحظه: يمكن وضع الأنابيب التي تحتوي على المجسات النانوية المرجعية من الخطوة 4.1 داخل المنطقة المصورة إذا رغبت في ذلك ، لتوفير معايير مرجعية داخلية للتحليل اللاحق. تأكد من عدم وصول مصادر الضوء الدخيلة بخلاف الليزر إلى الهدف.
5. اختياريا ، قم بإعداد العينة للمعالجة النسيجية والتحقق من صحتها عن طريق التثبيت في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS طوال الليل عند 4 درجات مئوية. اشطفها باستخدام PBS عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة مرتين على الأقل. احتفظ بالعينة في 70٪ من الإيثانول في الماء حتى المعالجة النسيجية القياسية وتضمين البارافين. للتحقق النسيجي من الأورام ، يمكن تلطيخ الأقسام (بسمك 5 ميكرومتر) من أعماق مختلفة من كتلة البارافين بالهيماتوكسيلين واليوزين (H & E).

المواد