نظام الثقافة القريبة: تقنية زراعة في المختبر لدراسة إشارات الباراكرين بين الخلايا

الملخص

المصدر: Dasari، S. et al. طريقة ثقافة قريبة لدراسة إشارات paracrine بين الخلايا.J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نقوم بتطوير نموذج زراعة مشتركة قريبة لخلايا سرطان المبيض وخلايا الظهارة المتوسطة البشرية الأولية. يسمح هذا النموذج ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية بدراسة إشارات paracrine ، حيث يتم الحفاظ على التركيزات الموضعية للعوامل المفرزة مع منع الاتصال الخلوي المباشر.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >أ. تحضير الخلية

1. عزل واستزراع الخلايا المتوسطة الأولية البشرية
   1. عزل الخلايا المتوسطة الأولية البشرية (HPMCs) من الثرب البشري وزراعتها في وسط نمو كامل [Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني ، و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين ، و 1٪ أحماض أمينية غير أساسية ، و 1٪ فيتامينات] عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظه: عادة ما تزرع HPMCs إلى التقاء بنسبة 100٪ (الشكل 1 أ).
2. ظروف نمو خلايا سرطان المبيض
   1. تنمو خلايا سرطان المبيض HeyA8 في وسط نمو كامل عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
      ملاحظه: استخدم خلايا HeyA8 التي نمت إلى حوالي 80٪ من التقاء (الشكل 1 ب).

B. ثقافة الخلية

1. إعداد الثقافة القريبة
   1. استخدم إدخالات Transwell لألواح 6 آبار بغشاء بولي كربونات معالج بزراعة الأنسجة بسمك 10 ميكرومتر مع مسام 0.4 ميكرومتر (10⁸ مسام / سم²) ومنطقة نمو 4.67 سم². إذا لزم الأمر ، قم بتحسين أحجام الإدراج المختلفة عن طريق تحجيم عدد الخلايا المصنفة وفقا لمساحة سطح النمو. وسط نمو كامل دافئ ، تربسين ، ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
2. تحضير الإدخالات
   1. لزرع خلايا HeyA8 على السطح السفلي لغشاء الإدخال ، قم بإزالة الملحق من عبوته باستخدام ملقط معقم وضعه مقلوبا في طبق ثقافة معقم مقاس 15 سم.
   2. استخدم طبقا مقاس 15 سم ، حيث يحتوي على عمق لاستيعاب الملحق المقلوب ، أو استبدله بأي حاوية معقمة مناسبة. اعتمادا على التجربة ، ضع العدد المطلوب من الإدخالات في الطبق مقاس 15 سم.
   3. قم بتسمية عناصر التحكم الثلاثة والشروط التجريبية الثلاثة وفقا لذلك بعلامة على حافة الإدخالات.
3. تحضير الخلايا السرطانية
   1. لتربسين خلايا HeyA8 التي تنمو عند التقاء 80٪ في قارورة 25 سم² (~ 2 × 10⁶ خلايا) ، أضف 1 مل من التربسين (0.25٪) لمدة 40-60 ثانية وتحييد التربسين ب 6 مل من وسط النمو الكامل.
   2. الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسط النمو الكامل. عد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء.
4. بذر الخلايا السرطانية
   1. 100,000 خلية / مل من خلايا HeyA8 الحية في وسط نمو كامل. قم بزرع 80,000 خلية HeyA8 معلقة بعناية في 800 ميكرولتر من وسط النمو الكامل في الجزء السفلي من الملحق (الذي يواجه الآن لأعلى ، لأنه مقلوب).
   2. قم بزرع الخلايا لتشكيل شكل يشبه القبة بحيث تظل الخلايا على الملحق (الشكل 1 ج). ابدأ من مركز الغشاء وتحرك للخارج في دوائر متحدة المركز أثناء سحب العينة ببطء. تجنب الذهاب لأكثر من 3 مم من الحافة لمنع أي انسكاب للوسط.
      ملاحظه: يعتمد عدد الخلايا المزروعة على معدل نمو الخلايا ومدة التجربة. تم تحسين عدد خلايا HeyA8 المصنفة لهذه الثقافة القريبة ، وستكون الخلايا ملتقية بنسبة 80-90٪ في نهاية اليوم الثالث.
قيمة
5. مرفق الخلايا السرطانية
   1. قم بتغطية الطبق مقاس 15 سم وانقل الطبق الذي يحتوي على الإدخالات بعناية إلى حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂. من الأهمية بمكان عدم تعطيل انخفاض الوسط والخلايا على الإدخال في هذه الخطوة. اترك الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات للسماح للخلايا السرطانية بالالتصاق بالملحق.
6. تحضير الخلايا المتوسطة
   1. بعد حوالي 4 ساعات ، قم بتربسين HPMCs المزروعة عند التقاء 100٪ في قارورة 75 سم² (~ 4 × 10⁶ خلايا) مع 2 مل من التربسين (0.25٪) لمدة 1-2 دقيقة وتحييد التربسين ب 12 مل من وسط النمو الكامل.
   2. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم عند RT لمدة 3 دقائق ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط النمو الكامل ، وعد الخلايا الحية باستخدام طريقة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء.
7. بذر الخلايا المتوسطة
   1. قم بتعليق 300,000 خلية / مل من HPMCs الحية في وسط نمو كامل. أضف 2.5 مل من وسائط النمو الكاملة الطازجة إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار. أحضر الطبق مقاس 15 سم الذي يحتوي على الإدخالات بعناية إلى غطاء السلامة الحيوية. باستخدام ملقط معقم ، اقلب الملحق وضعه في بئر الصفيحة المكونة من 6 آبار بحيث تكون منتصبة ، مع ربط خلايا HeyA8 بالسطح السفلي مغمورة في وسط النمو الكامل (الشكل 1 ج).
   2. بذور 450.000 HPMCs معلقة في 1.5 مل من وسط النمو في داخل الإدخالات مع خلايا HeyA8 متصلة بالسطح المواجه لقاع البئر (الشكل 1C) أو بإدخالات بدون أي خلايا HeyA8 لعناصر تحكم HPMC. أضف 1.5 مل من وسط النمو بدون خلايا إلى عناصر تحكم HeyA8.
8. تنمية الثقافة القريبة
   1. دع الثقافة القريبة تنمو في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 72 ساعة. إذا لزم الأمر ، يمكن تجديد الوسيط على النحو التالي.
      1. للجزء الداخلي من الملحق ، قم بإزالة 750 ميكرولتر وأضف 750 ميكرولتر من وسط النمو الكامل الطازج.
      2. بالنسبة للجزء الخارجي من الملحق (اللوحة المكونة من 6 آبار) ، قم بإزالة 1 مل وأضف 1 مل من وسط النمو الكامل الطازج. تم اختيار 1 مل لراحة تغيير الوسيط في خطوة واحدة. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إزالة 1.25 مل واستبداله بدلا من ذلك.

النتائج

الشكل 1: تجميع نظام الاستزراع القريب.(أ) تظهر هذه اللوحة خلايا الظهارة المتوسطة الأولية البشرية (HPMCs). (ب) تظهر هذه اللوحة خلايا سرطان المبيض HeyA8. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر (A-B). (ج) تم زرع خلايا HeyA8 على السطح السفلي لإدراج الويل مع مسام 0.4 ميكرومتر. بمجرد ربط الخلايا ، تم وضع الملحق في بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار تحتوي عل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 24 مم دعم نفاذية Transwell مع 0.4 ميكرومتر إدراج غشاء بولي كربونات المسام كورنينج (كوستار) 3412 • غشاء بولي كربونات شفاف بسمك 10 ميكرومتر.
• معالج من أجل الارتباط الأمثل للخلايا.
• معبأة 6 إدخالات في صفيحة 6 آبار ، 4 أطباق لكل علبة.
• يجب تلطيخ الغشاء لرؤية الخلية.
• معقم بإشعاع جاما. 6 صحن بئر كورنينج (فالكون) 353046 قاع مسطح ، معالج ب TC ، معقم ، مع غطاء طبق ثقافة 15 سم كورنينج (فالكون) 353025 طبق ثقافة الخلايا المعقم المعالج ب TC DMEM كورنينج (سيلجرو) 10-013-السيرة الذاتية البنسلين ستربتومايسين كورنينج 30-002-CI الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM كورنينج (سيلجرو) 25-025-CI ماصات أي صنع جيد حاضنة CO2 أي صنع جيد خزانة السلامة الحيوية من المستوى الثاني أي صنع جيد