نمذجة ورم خبيث لسرطان المبيض في بطانة التجويف البريتوني: طريقة لإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر للبطانة البريتونية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Peters ، P. N. et al. نمذجة الخطوات المبكرة لانتشار سرطان المبيض في ثقافة النمط العضوي للتجويف البريتوني البشري. J. Vis. Exp. (2015)

< p class = "jove_content" >في هذا الفيديو ، نوضح تطوير نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر لبطانة التجويف البريتوني. يمكن أن تساعد هذه الثقافة العضوية في التحقيق في التصاق خلايا سرطان المبيض وغزوها وانتشارها.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. طلاء ثقافة النمط العضوي

1. حرر NOF (الخلايا الليفية العقلية الطبيعية) من قارورة مزرعة مقاس 75 سم² عن طريق الشطف ب 10 مل من PBS متبوعا ب 3 مل من 0.25٪ تريبسين / 25 ملي EDTA لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
2. انقل الخلايا المصابة بالتربسين إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 50 مل وقم بتدويرها بحجم 0.5 جم × 3 دقائق. استخدم عداد الخلايا لحساب الخلايا المستردة من قارورة الزراعة.
3. قم بتخفيف الخلايا بالحجم المناسب لوسائط النمو الكامل إلى صفيحة 2,000-4,000 NOF لكل 100 ميكرولتر على صفيحة سوداء ذات قاع شفاف و 96 بئرا. أضف 0.5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من الكولاجين الأول ذيل الفئران إلى خليط الخلية قبل الطلاء. دع الخلايا تجلس عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في بيئة رطبة لمدة 4 ساعات على الأقل ، أو حتى تلتصق الخلايا بسطح اللوحة.
4. حرر HPMC (الخلايا الظهارية المتوسطة البشرية الأولية) من قارورة المزرعة باستخدام نفس الطرق الموضحة في الخطوتين 1.1 و 1.2. قم بتخفيف الخلايا بالكمية المناسبة من وسائط النمو الكامل إلى صفيحة 10,000-20,000 HPMC لكل 50 ميكرولتر فوق NOF المطلي بالفعل بالكولاجين I في 96 بئرا. دع الخلايا تجلس عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في بيئة رطبة لمدة 18 ساعة على الأقل قبل بدء التجارب.
5. زراعة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الذي يعبر عن خلايا سرطان المبيض HeyA8 في وسط النمو الكامل. يتم تصنيف خلايا سرطان المبيض HeyA8 بالفلورسنت عن طريق التعبير عن ناقل فيروسي يعبر عن مجدافيات الأرجل cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). يجب أن تكون خلايا سرطان المبيض HeyA8 ملتقية بنسبة 80-90٪ في يوم الاستخدام (مرحلة النمو اللوغاريتمي). حرر الخلايا من لوحة المزرعة وعدها باستخدام نفس الطرق الموضحة في الخطوات 1.1-1.2 للخلايا الأولية.
6. اسمح لخلايا سرطان المبيض بالتعافي في وسط النمو الكامل لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في أنبوب مخروطي الشكل مع إغلاق الغطاء بشكل غير محكم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات برنامج تلفزيوني فيشر ساينتيك SH3001304 أطباق ثقافة 15 سم BD Biosciences 353025 DMEM مع L-Glutamine كورنينج 10-013-السيرة الذاتية فيتامينات MEM كورنينج 25-020-سنتر الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM كورنينج 25-025-CI البنسلين - ستربتومايسين كورنينج 30-002-CI شاكر ثيرمو فيشر ماكس كيو 4450 الطرد المركزي إيبندورف 5702 حاضنه ثيرمو فيشر فورما سيريز الثاني مغلف بالماء
حاضنة CO2 موديل 3100 التربسين EDTA ، 1x (0.25٪) كورنينج 25-053-CI قوارير T-75 BD Biosciences 353136 قوارير T-175 BD Biosciences 353112 نصائح الماصة رينين P2 و P10 و P20 و P200 و P1000 نصائح الماصة كورنينج نصائح مصفاة P2 ، P10 ، P20 ، P200
و P1000 عداد الخلية إنفيتروجين الكونتيسه غرفة عد خلايا الكونتيسة
الشرائح إنفيتروجين سي 10313 تريبان بلو ستين (0.4٪) جيبكو 15250-061 الكولاجين من النوع الأول (ذيل الفئران) BD Biosciences 354236 96 لوحة بئر ، قاع شفاف ، أسود BD Biosciences 353219