$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
1. عزل وثقافة الخلايا اللحمية الأولية غير المحولة
- جمع الأنسجة البشرية وتحضيرها.
- احصل على عينات من الثرب البشري ، 2 سم3 ، تمت إزالتها أثناء جراحة البطن ، واغمر الأنسجة على الفور في محلول ملحي مخزن بالفوسفات RT (PBS) (الشكل 1 أ). عادة ما تنتج قطعة من الثرب 3 سم × 2 سم 1 مليون خلية متوسطة بشرية أولية (HPMC) و 200,000 من الخلايا الليفية البشرية الأولية أو الخلايا الليفية العقلية الطبيعية (NOF).
- قم بتدوير PBS ، تم غمر الأنسجة عند 0.5 × جم لمدة 3 دقائق في أقرب وقت ممكن بعد التجميع (< 2 ساعة في PBS) ونقل الأنسجة إلى 20 مل من PBS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع 5 مم 3 عن طريق فرمها بمشارط بقطر 15 سم ، طبق ثقافة معقم (الشكل 1 ب).
- عزل الخلايا الظهارية المتوسطة البشري الأولي
- لعزل HPMC ، انقل الأنسجة المفرومة إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل وانتظر دقيقة واحدة حتى تطفو القطع الصلبة إلى الأعلى (الشكل 1C و D). سيكون HPMC وخلايا الدم الحمراء (RBC) موجودين في السائل الموجود في الأسفل. استخدم ماصة لإزالة السائل من قاع الأنبوب إلى أنبوب مخروطي جديد. قم بتدوير السائل لأسفل عند 0.5 × جم لمدة 3 دقائق واستنشق المادة الطافية من حبيبات HPMC / RBC.
- كرر العملية ثلاث مرات: أضف 20 مل من PBS إلى الأنسجة المفرومة ، واترك الأنسجة ترتفع ، وقم بإزالة السائل من القاع باستخدام ماصة وفي أنبوب HPMC / RBC ، ثم قم بالتدوير لأسفل ، وقم بإزالة المادة الطافية. بعد اكتمال جميع الدورات وشفط المادة الطافية ، ستحتوي الحبيبات على HPMC و RBC.
- ضع جميع الخلايا من الحبيبات في قارورة 75 سم2 في 15 مل من وسائط النمو الكامل (DMEM مع 10٪ مصل بقري جنيني [FBS] ، 1٪ فيتامينات MEM [93 مجم / لتر] ، 1٪ أحماض أمينية غير أساسية MEM [81.4 مجم / لتر] ، 1٪ بنسلين ستربتومايسين [Pen-Strep ، 100 U / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين]).
- قم بإجراء غسل PBS ثانوي لعزل HPMCs الإضافية.
- لغسل PBS الثانوي ، رج الأنسجة الصلبة المتبقية عند 200 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 20 مل من PBS ، ثم انتظر 1 دقيقة حتى تطفو الأنسجة إلى الأعلى. قم بإزالة السائل من قاع الأنبوب إلى أنبوب جديد ، وجهاز الطرد المركزي عند 0.5 × جم لمدة 3 دقائق ، وشفط المادة الطافية.
- ضع كل HPMC / RBC من غسل PBS الثانوي في قارورة منفصلة مقاس 75 سم2 في 15 مل من وسائط النمو الكاملة.
- لعزل أي HPMC متبقي ، رج الأنسجة المفرومة عند 200 دورة في الدقيقة ، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في 20 مل من محلول 1: 1 0.25٪ تريبسين 25 ملي متر EDTA: PBS من حيث الحجم. اسمح للأنسجة بالارتفاع ، واجمع السائل الموجود في الجزء السفلي من الأنبوب في أنبوب جديد سعة 50 مل ، ثم قم بالدوران لأسفل عند 0.5 × جم لمدة 3 دقائق.
- قم بشفط المادة الطافية وقم بوضع كل HPMC / RBC في قارورة منفصلة مقاس 75 سم2 في 15 مل من وسائط النمو الكاملة.
- زراعة الخلايا المطلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في بيئة رطبة. قم بتغذية الخلايا المطلية بإضافة 15 مل من وسائط النمو الكامل في اليومين 3 و 5 دون إزالة الوسائط المستهلكة. يمكن زراعة HPMC لمدة 5-7 أيام قبل الانقسام.
- استخدم HPMC منخفض المرور (حتى المقطع 2) في جميع التجارب لتقليل عدم التمايز وتعديل النمط الظاهري الأصلي. استخدم مجهرا واسع المجال ويفضل أن يكون هدفا 20x مع قدرات تباين التداخل التفاضلي البلاستيكي أو هدف 4-20x مع قدرات تباين الطور (مرشحات تباين الطور على المجهر) لالتقاط جميع صور الخلايا ، وهدف 10x () في المجال الساطع لتحليل تلطيخ الكيميائي المناعي 3،3'-Diaminobenzidine (DAB).
- تأكد من أن HPMC عبارة عن مكعبات وعبر عن السيتوكيراتين 8 والفيمنتين عن طريق إجراء الكيمياء المناعية (الشكل 2 أ ، ج ، ه).
