نمذجة استعمار الخلايا السرطانية للمبيض للثرب: طريقة خارج الجسم الحي لإنشاء استعمار البقع اللبنية لخلايا سرطان المبيض المسماة بالفلورسنت في مستخلصات ثرب الفئران

الملخص

المصدر: Krishnan، V. et al. In Vivo و Ex Vivo Approach لدراسة الاستعمار النقيلي لسرطان المبيض لهياكل البقع اللبنية في الدهون الصفاقية. J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نؤسس ثقافة أعضاء عقلية خارج الجسم الحي مغطاة بخلايا سرطان المبيض التي تعبر عن GFP لدراسة استعمار سرطان المبيض داخل النبتة العقلية. يحلل هذا البروتوكول هياكل الخلايا المناعية داخل الثرب المعروف باسم البقع اللبنية التي تعزز النقائل.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. استعمار بقعة حليبي Ex Vivo

1. وضع الشروط الأساسية لزراعة الأعضاء العقلية خارج الجسم الحي
   1. ضع كل ثرب في إدراج لوحة ثقافة واحدة وضعها داخل بئر واحد من صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط DME / F12 التي تحتوي على 20٪ FCS. الحفاظ على مزارع الأعضاء عند 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 24 إلى 48 ساعة و / أو نقاط زمنية إضافية. استخدم ثلاث أومينتا مستقلة (عينات ثلاثية) لكل حالة (على سبيل المثال ، نوع الوسائط / النقطة الزمنية).
   2. للتأكد من سلامة الأنسجة في نقاط النهاية التجريبية، قم بإصلاح العينات ومعالجتها كما هو موضح في الخطوة 1.1.3. يمكن أن يؤدي حساب الخلايا الشحمية السليمة مقابل الخلايا الشحمية النخرية في أقسام H & E إلى تقييم سلامة الأنسجة. مطلوب ما لا يقل عن ~ 120 خلية من خمس عينات بيولوجية لصياغة نسبة مئوية من الأنسجة الحية الموجودة.
   3. لقياس وظيفة الأنسجة ، ضع أومينتا (ن = 3) في آبار منفصلة من صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائط DME / F12 مع 20٪ FCS. اسمح للأومنتا بتكييف الوسائط عند 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة ثم قم بإزالة 250 ميكرولتر لاستخدامها في اختبار IL-6 ELISA.
2. الزراعة المشتركة خارج الجسم الحي لثرب الفأر مع خلايا SKOV3ip.1-GFP
   1. قم بتنمية وإعداد الخلايا ذات العلامات الفلورية عن طريق سحب 1 × 10⁶ خلايا مذابة في 10 مل من الوسائط في قارورة T-75. اسمح للخلايا بالنمو عند 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ CO₂ حتى تصل إلى 70٪ من التقاء. التربسين وإعادة التعليق بتركيز 2 × 10⁶ خلايا لكل مل.
   2. ضع ~ 6 ميكرولتر من لاصق الأنسجة على غشاء ملحق المزرعة واتركه يجف في الهواء. اغسل الغشاء مرتين بالماء المعقم لإزالة أي مادة لاصقة زائدة. جفف الأغشية بالهواء تحت غطاء رقائقي.
   3. قم باستئصال الأومينتا بعناية وإرفاقها بالغشاء المطلي بالمادة اللاصقة باستخدام ملقط معقم. اترك الأنسجة تلتصق بالغشاء لمدة 1 دقيقة قبل إضافة الوسائط. أضف 500 ميكرولتر من معلق الخلية فوق كل شرب في كل إدراج مزرعة. املأ المنطقة المحيطة بغرفة البور ب 2.5 مل من DME / F-12.
   4. احتضان أومينتا مع تعليق الخلية لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية في بيئة 5٪ CO₂. قم بإزالة وغسل الأومنتا بعناية باستخدام ~ 10 مل من PBS. تصور بؤر الخلايا السرطانية الفلورية باستخدام نظام تصوير الفلورسنت المناسب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أدوات التشريح أدوات العلوم الدقيقة غير أ جيمسا فلوكا / سيجما ألدريتش 48900 5٪ فورمالين سيغما HT501320 DMEM كورنينج 10-013-السيرة الذاتية برنامج تلفزيوني كورنينج 21-040-السيرة الذاتية بدون كالسيوم ومغنيسيوم كولاجيناز ورثينجتون LS004196 إدراج لوحة ثقافة Millicell ميليبور PICM01250 سيل تاك كورنينج 354240