فحص إزالة الظهارة المتوسطة: تقنية في المختبر لتحديد قدرة غزو الكرويات الكروية لسرطان المبيض في طبقات أحادية الخلايا الظهارية المتوسطة

الملخص

المصدر: Davidowitz ، R. A. et al. في المختبر فحص التصفية المتوسطة الذي يصمم الخطوات المبكرة لرم خبيث سرطان المبيض. J. Vis. Exp.(2012)

يصف هذا الفيديو تقنية لقياس تفاعل كرويات سرطان المبيض مع الخلايا المتوسطة ، باستخدام الخلايا ذات العلامات الفلورية والفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني. هذا الفحص في المختبر يحدد التفاعل بين نقائل الخلايا الكروية لخلايا سرطان المبيض والخلايا المتوسطة المبطنة للتجويف البريتوني في الجسم الحي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تكوين الخلايا الكروية لسرطان المبيض

1. يتم زراعة خلايا سرطان المبيض التي تعبر عن RFP في 10٪ Base Medium (وسيط زراعة خلية مخصص يحتوي على خليط 50:50 من 199 و MCDB105 ، و 10٪ مصل بقري جنيني معطل ، و 1٪ بكتيريا القلم). للتعبير عن RFP في خلايا سرطان المبيض غير المسماة ، قم بنقل الخلايا باستخدام بلازميد يحتوي على RFP وحدد الخلايا التي تعبر عن RFP. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام النواقل الفيروسية للتعبير عن البروتينات الفلورية بشكل عابر ، أو يمكن تحضين الخلايا مسبقا بصبغة تعقب الخلايا الفلورية الحمراء (Invitrogen).
2. قبل تكوين كرويات سرطان المبيض ، من الضروري تحضير أطباق ثقافة منخفضة الالتصاق 96 جيدا مستديرة القاع. لإنتاج ألواح ثقافة منخفضة الالتصاق ، أضف 30 ميكرولتر بولي هيما (6 مجم بولي هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات في 1 مل 95٪ إيتوهايوكس) إلى كل بئر من طبق زراعة الخلايا المكون من 96 بئرا. يتم تحضين الألواح المكونة من 96 بئرا في حاضنة غير مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لتبخر الإيثانول ، تاركة طبقة من بولي هيما على كل بئر. يمنع فيلم poly-HEMA الخلايا من الالتصاق بقاع البئر ، مما يجبر الخلايا على النمو في حالة تعليق. [بدلا من ذلك ، يمكن استخدام لوحات ثقافة التثبيت المنخفضة للغاية (Corning).]
3. بعد ذلك ، قم بتربسين خلايا سرطان المبيض ، وحبيبات الخلايا في جهاز طرد مركزي منضدي (Heraeus) عند 900 RCF لمدة 3 دقائق. قم بشفط المادة المطفية وإعادة تعليقها في 10٪ وسط أساسي.
4. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
5. اضبط تركيز الخلايا بحيث يكون هناك 100 خلية لكل 50 ميكرولتر من 10٪ وسط أساسي.
6. أضف 50 ميكرولتر من معلق الخلية المخفف المعلق بشكل موحد إلى كل بئر من طبق الاستزراع المطلي ب 96 بئرا بولي هيما.
7. احتضان الصفيحة المكونة من 96 بئرا في حاضنة ثقافة الخلايا 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة (يجب زيادة هذا المقدار من الوقت أو تقليله اعتمادا على مقدار الوقت الذي يستغرقه خط خلية معين لتكوين كرويات متعددة الخلايا أو الظروف التجريبية المرغوبة) للسماح لخلايا سرطان المبيض بالتجمع معا ، وتشكيل كروي واحد متعدد الخلايا في كل بئر. يمكن أن تخضع بعض الخلايا السرطانية لموت الخلايا المبرمج خلال هذه الفترة ، لذلك من الضروري اختيار وقت قبل تحريض موت الخلايا المبرمج.

< p class = "jove_title" >2. تكوين أحادي الطبقة للخلية

المتوسطة

1. في غطاء مزرعة الخلايا ، قم بتغطية آبار طبق MatTek ذو القاع الزجاجي المكون من 6 آبار مسبقا بالفبرونيكتين عن طريق إضافة 2 مل من محلول 5 ميكروغرام من الفيبرونكتين / مل PBS إلى كل بئر من الطبق واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تسمح الجودة البصرية للقيعان الزجاجية في أطباق MatTek بالتصوير المجهري عالي الدقة.
2. يتم زراعة الخلايا المتوسطة التي تعبر عن GFP في وسط أساسي بنسبة 10٪. قم بتدوير صفيحة من الخلايا المتوسطة ، وقم بتدويرها في جهاز طرد مركزي منضدي (Heraeus) بسرعة 900 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق ، وشفط المادة الطافية ، وأعد تعليقها في 10٪ Base Medium. كانت الخلايا المتوسطة المستخدمة هنا تعبر بالفعل عن GFP عند الحصول عليها ، ولكن يمكن إنتاج الخلايا المتوسطة غير المسماة عن طريق النقل باستخدام البلازميد الذي يحتوي على GFP (cDNA) أو احتضان الخلايا مسبقا في صبغة تعقب الخلايا الفلورية الخضراء (Invitrogen).
3. بعد حضانة الفيبرونيكتين لمدة 30 دقيقة (في الخطوة 2.1) ، اغسل آبار طبق MatTek ب 2 مل PBS.
4. استنشق PBS واللوحة 6 × 10⁵ خلية متوسطة الظهارة لكل بئر في كل بئر من طبق MatTek المكون من 6 آبار. احتضن طبق MatTek في حاضنة زراعة الخلايا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل للسماح للخلايا المتوسطة بالالتصاق بالطبق وتشكيل طبقة أحادية.

3. فحص تصفية الخلايا الظهارية

المتوسطة

1. استخدم ماصة لجمع الكرويات لسرطان المبيض من الصفيحة المطلية ب 96 بئرا بولي هيما.
2. استنشق الوسط من بئر واحد من طبق MatTek المكون من 6 آبار والذي يحتوي على طبقة أحادية الخلية الظهارية. يغسل مرة واحدة باستخدام 2 مل PBS. أضف جميع الكرويات من اللوحة المكونة من 96 بئرا إلى بئر واحد من طبق MatTek (~ 3 أضعاف عدد الكرويات التي سيتم تصويرها لحساب هبوط الكرويات على جزء من الطبق لا يمكن تصويره).
3. ضع طبق MatTek على مسرح مجهر مضان واسع المجال مقلوب قادر على إجراء تصوير بفاصل زمني لمدة 8 ساعات على الأقل. استخدم مرحلة آلية لتصوير مواضع متعددة في الطبق ، مع أحداث إقحام كروية متعددة ، في تجربة واحدة. نحن نستخدم مجهر اللقطات المتتابعة بفاصل زمني بمحرك مقلوب بمحرك Ti-E مع نظام تركيز مثالي متكامل وبصريات تكبير منخفضة [20x-0.75 فتحة عددية (NA)] / تباين التداخل التفاضلي NA (DIC) ، ومصباح إضاءة هالوجين من نيكون مع مكثف مسافة عمل طويلة (LWD) 0.52 NA ، ومرشحات الإثارة والانبعاث السريعة من نيكون (<وقت التبديل 100 مللي ثانية) (GFP Ex 480/40 ، Em 525/50 ، RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50) ، مصاريع ذكية سريعة الإرسال ومسار ضوء التألق Sutter ، ومرحلة آلية مشفرة خطية من نيكون ، وكاميرا Hamamatsu ORCA-AG المبردة بالشحن المقترن بالشحن (CCD) ، وغرفة حضانة مجهر مصممة خصيصا مع التحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون₂ ، وبرنامج Nikon NIS-Elements AR الإصدار 3 ، وجدول عزل اهتزاز TMC.
4. سوف تستقر كرويات خلايا سرطان المبيض في قاع الطبق وتلتصق بطبقة أحادية الخلية المتوسطة الظهارية. اجمع صور GFP و RFP و Phase ل 20+ تفاعلات كروية / أحادية الطبقة كل 10 دقائق ، لمدة 8 ساعات.
5. ستغزو كرويات خلايا سرطان المبيض التي تعبر عن RFP الطبقة الأحادية للخلية المتوسطة التي تعبر عن GFP مما يخلق ثقبا في الطبقة الأحادية. بعد 8 ساعات ، قم بقياس أحجام الثقوب عن طريق تتبع الثقوب السوداء في صور GFP باستخدام برنامج Elements (أو برنامج آخر مناسب مثل الصورة J). قم بتطبيع حجم الثقب إلى الحجم الكروي الأولي بقسمة حجم الثقب في 8 ساعات على حجم الكروي في صورة RFP المقابلة في الوقت صفر. في هذا المثال ، تم قياس حجم الثقب مرة واحدة فقط ، ولكن يمكن قياسه عدة مرات خلال التجربة التي استمرت ثماني ساعات لفهم ديناميكيات الإقحام بشكل أفضل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات OVCA433 خلايا سرطان المبيض هدية من دكتور دينيس سلامون خلايا الظهارة المتوسطة ZT هدية من دكتور تان إينس متوسط 199 جيبكو من لايف تكنولوجيز 19950 MCDB105 شركة تطبيقات الخلية 117-500 FBS-الحرارة معطل جيبكو ، من لايف تكنولوجيز 10082 القلم الاسترببوئي جيبكو ، من لايف تكنولوجيز 15070 96 طبق بئر كورنينج 3799 بولي هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات (بولي هيما) 192066-25 جم سيجما ألدريتش لمحلول بولي هيما ، قم بإذابة مسحوق 6 مجم بولي هيما في 1 مل من 95٪ EtOH إيتو هيه فارمكو AAPER 111 إيه سي إس 200 خفف إلى 95٪ في dH20 غطاء مزرعة الخلية نوير NU-425-300 حاضنة زراعة الأنسجة ثيرمو فيشر العلمي ، وشركة 3110 حاضنة لألواح بولي هيما 305 أجهزة Labline الإمبراطورية الثالثة جهاز طرد مركزي منضدية أدوات هيريوس 75003429/01 6 طبق ذو قاع زجاجي جيدا شركة ماتيك P06G-1.5-20-F فيبرونيكتين سيجما ألدريتش F1141-1MG برنامج تلفزيوني سيلجرو 21-040-السيرة الذاتية مجهر نيكون إنسترومنتستر مجهر الفاصل الزمني المضان الآلي المقلوب Ti-E مع نظام التركيز المثالي المتكامل عدسة نيكون إنسترومنتستر 20X-0.75 المساحة العددية مصباح الهالوجين نيكون إنسترومنتستر 0.52 NA مكثف مسافة العمل الطويلة مرشحات الإثارة والانبعاث شركة كروما تكنولوجي كورب. GFP Ex 480/40 ، Em 525/50 RFPmCherry Ex 575/50 Em 640/50 مسار الضوء المرسل والإيبي فلوريس شركة سوتر للأدوات مصاريع ذكية مرحلة آلية مشفرة خطية نيكون إنسترومنتستر كاميرا جهاز مشحونة مشحونة مبردة شركة هاماماتسو أوركا إيه جي غرفة حضانة المجهر مع التحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون حسب الطلب طاولة عزل الاهتزاز TMC برنامج NIS-Elements نيكون إنسترومنتستر الإصدار 3