تحديد التردد الميداني الأمثل لعلاج الورم المثبط للخلايا السرطانية: طريقة غير جراحية في المختبر لتقييم تأثير TTFields على بقاء الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Porat, Y. et al. تحديد التردد التثبيطي الأمثل للخلايا السرطانية باستخدام مجالات معالجة الأورام (TTFields). J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تأثير تطبيق TTField على نمو خطوط خلايا سرطان المبيض في المختبر. يمكن أن يساعد هذا الاختبار في تحديد التردد الأمثل للمجال الكهربائي الذي يمكن أن يؤدي إلى أقصى قدر من الانخفاض في عدد الخلايا السرطانية.

البروتوكول

1. نظام تطبيق TTFields في المختبر - صيانة اللوحة الأساسية والأطباق

1. اشطف الأطباق وأغطية الأطباق تحت ماء الصنبور الجاري. ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات وجففها بالهواء ووجهها لأسفل.
2. إذا تمت إضافة عامل / دواء علاج كيميائي إلى الأطباق في تجربة سابقة ، فاملأ كل طبق بمحلول منظف خفيف بنسبة 5٪ واتركه طوال الليل.
   1. اشطف الأطباق جيدا تحت ماء الصنبور الجاري لتجنب أي آثار للمنظفات داخل الطبق. اشطف الأطباق وأغطية الأطباق بالماء منزوع الأيونات وجففها بالهواء ووجهها لأسفل.
3. أدخل الأطباق النظيفة والجافة بأغطيتها في أكياس التعقيم. أغلق الأكياس وضعها في الأوتوكلاف ، بحيث تكون الأطباق متجهة لأسفل. الأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة لا تزيد عن 121 درجة مئوية.
4. اضبط الأوتوكلاف على برنامج جاف ، وافتح باب الأوتوكلاف جزئيا ، وجفف الأطباق لمدة 30 دقيقة.
5. امسح اللوحة الأساسية بقطعة قماش مبللة قليلا بنسبة 70٪ من الإيثانول.

2. إعداد التجربة

ملاحظة: جميع المعدات والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول موصوفة في قائمة المواد. يجب تنفيذ جميع الخطوات أدناه داخل خزانة التدفق الصفحي مع الحفاظ على الظروف المعقمة.

1. قم بإعداد أطباق وأغطية TTFields نظيفة ومعقمة، كما هو موضح في القسم 1. امسح اللوحة الأساسية بقطعة قماش مبللة قليلا بنسبة 70٪ من الإيثانول.
2. قم بتركيب أطباق TTFields مع الأغطية على لوحة القاعدة عن طريق الضغط برفق على الطبق وتدويرها في اتجاه عقارب الساعة بحوالي 5 مم حتى تغلق حافة الطبق على المسامير الثلاثة الموجودة على لوحة القاعدة. ضع غطاء معقم مقاس 22 مم (بلاستيك أو زجاج معالج) في قاع كل طبق.
3. تحضير تعليق الخلية في وسط نمو كامل (وسط النسر المعدل من Dulbecco ل U-87 MG و F98 ؛ RPMI ل A2780 و OVCAR-3 ؛ مكمل كما هو موضح في قائمة المواد).
   ملاحظة: تعتمد تركيزات الخلايا على أنواع الخلايا ومدة التجربة. لا ينبغي تجاوز نمو الخلايا المتقاربة بنسبة 80٪ -90٪ بنهاية التجربة.
   تنبيه: قد تمثل خطوط الخلايا البشرية خطرا بيولوجيا ويجب التعامل معها بتدابير السلامة المناسبة.
4. ضع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية (عادة 5,000-20,000 خلية في 200 ميكرولتر لتجربة مدتها 72 ساعة ، اعتمادا على وقت المضاعفة) كقطرة في وسط كل غطاء وقم بتغطيتها بأغطية الأطباق.
5. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 2 حتى تلتصق الخلايا ؛ يمكن الحضانة بين عشية وضحاها في هذه المرحلة.
6. استنشق السوائل من القطرة باستخدام ماصة سعة 200 أو 1,000 ميكرولتر.
7. ضع 2 مل من وسط النمو الكامل برفق لملء كل طبق. استخدم طرفا معقما للسحب واضغط برفق على حواف الغطاء لتحرير فقاعات الهواء التي يتم التقاطها أحيانا تحت الشريحة.
8. غطي الأطباق بأغطيتها وضعيها داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية حتى بدء علاج TTFields.

3. تطبيق TTFields

1. انقل الأطباق الأساسية مع أطباق TTFields المرفقة إلى حاضنة CO₂ مبردة.
   ملاحظة: سيولد تطبيق TTFields في المختبر حرارة. لذلك ، مطلوب حاضنة مبردة للتعويض عن ارتفاع درجة حرارة الأطباق. ستنتج كثافة TTFields المرتفعة مزيدا من الحرارة وستتطلب درجات حرارة محيطة أقل للحاضنة (انظر الجدول 1). يتم تحقيق كثافة TTFields ذات الصلة سريريا عندما تتراوح درجة حرارة الحاضنة لتطبيق TTFields بين 18-30 درجة مئوية.
2. قم بتوصيل موصل أنثى الكابل المسطح بلوحة القاعدة. قم بتشغيل مولد TTFields.
3. ابدأ تشغيل برنامج نظام تطبيقات TTFields في المختبر وحدد إعدادات التجربة.
   1. حدد تجربة جديدة. اكتب اسم التجربة ومالك التجربة في واجهة مستخدم البرنامج على شاشة الكمبيوتر. اضبط التردد ودرجة الحرارة المستهدفة لكل طبق أو طبق أساسي.
4. ابدأ تشغيل تطبيق TTFields باستخدام البرنامج.
5. تحقق من توصيل جميع الأطباق بشكل صحيح وتظهر باللون الأزرق الفاتح على الشاشة. إذا كان الطبق محاط بدائرة بإطار أحمر (بمعنى أنه غير متصل بشكل صحيح) ، فاضغط عليه برفق وقم بتدويره ببطء ذهابا وإيابا حتى تتم استعادة جهات الاتصال ويظهر الطبق باللون الأزرق الفاتح.
6. اترك نظام تطبيق TTFields في المختبر يعمل لمدة تصل إلى 24 ساعة.
7. إذا وصلت التجربة إلى نقطة النهاية الخاصة بها، فأوقف التجربة بالنقر فوق الزر إنهاء التجربة في البرنامج وانتقل إلى الخطوة 5. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فانقر فوق الإيقاف المؤقت للتجربة.
8. افصل موصل الكابل المسطح عن لوحة القاعدة. قم بإزالة لوحة القاعدة مع الأطباق من الحاضنة إلى خزانة تدفق رقائقية.
9. استبدل الوسيط في جميع الأطباق كل 24 ساعة وأعد الطبق الأساسي إلى الحاضنة المبردة. قم بتوصيل لوحة القاعدة بالمولد باستخدام الكابل المسطح. تابع التجربة بالنقر فوق الزر CONTINUE.

درجة الحرارة المحيطة للحاضنة شدة TTFields المتوقعة (درجة مئوية) (V / سم RMS) 18 1.62 19 1.55 20 1.48 دولار 21 1.41 دولار أمريكي 22 1.33 دولار أمريكي 23 1.26 24 1.19 25 1.12 26 1.04 دولار 27 0.97 28 0.9 29 0.83 دولار 30 0.76 < p class = "jove_content" > الجدول 1. درجة الحرارة المحيطة للحاضنة وشدة TTFields المتوقعة داخل طبق TTFields.

< p class = "jove_title" >4. عينات التحكم

ملاحظة: قم بزراعة خلايا التحكم في ظروف مشابهة للخلايا المعالجة ب TTFields، باستثناء تطبيق TTFields.

1. عينات التحكم في الألواح بنفس المعلق وعلى سطح مماثل يستخدم لطلاء العينات المعالجة ب TTFields.
2. ضع أطباق التحكم في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
3. استبدل الوسيط في الأطباق كل 24 ساعة ليتناسب مع الظروف المتوسطة للأطباق المعالجة ب TTFields.

5. نهاية التجربة

1. بعد النقر فوق END EXPERIMENT ، انتظر حتى يقوم البرنامج باسترداد جميع السجلات من النظام وحفظ السجلات على الكمبيوتر.
2. استخدم الزر REPORTS لمراجعة ملفات سجل درجة الحرارة والتيار والمقاومة لكل لوحة أساسية للتحقق من أن جميع الأطباق قد تمت معالجتها وفقا للخطة التجريبية.
   ملاحظة: يتم حفظ جميع التقارير والسجلات على الكمبيوتر بعد انتهاء التجربة ويمكن مراجعتها في أي وقت.
3. قم بإيقاف تشغيل مولد TTFields.
4. افصل الكبل المسطح عن لوحة القاعدة وقم بإزالته من الحاضنة.
5. لإزالة طبق خزفي ، اضغط لأسفل وقم بتدوير الطبق عكس اتجاه عقارب الساعة لفتحه من لوحة القاعدة.
6. خذ الأطباق إلى خزانة تدفق رقائقي وقم بإزالة الغطاء. انقلها إلى أطباق بتري معقمة تحتوي على محلول ملحي طازج متوسط أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمزيد من الفحص والتقييم.

المواد