$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على أجنة بيض الدجاج من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير البيض
- قبل استلام البيض ، قم بتجميع حاضنة البيض وموازنتها إلى 37.8 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت) مع رطوبة 60-70٪ باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظه: لتقليل مخاطر التلوث ، يمكن استخدام المياه المعقمة للتحكم في الرطوبة.
- عند استلام بيض دجاج رود آيلاند الأحمر المخصب من مورد بيض معتمد من الدرجة المختبرية ، امسح سطح القشرة بالمناشف الورقية بشكل جاف. يمكن استخدام منشفة ورقية مبللة قليلا لإزالة المواد الملتصقة. يجف على الفور.
ملاحظه: يمكن أن يؤدي ترطيب القشرة بسائل أقل من 43.3 درجة مئوية إلى إدخال البكتيريا في البيضة. إذا اختار المرء غسل البيض أو تطهيره ، فيجب أن تكون درجة حرارة السائل بين 43.3-48.9 درجة مئوية. يجب أن يتم اختيار المطهر بناء على الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب القلق.
- استخدم قلم رصاص أو قلم تحديد لتسمية التاريخ على البيضة. يعتبر هذا يوم التطوير 0.
- ضع البيض في حاضنة البيض واحتضنه لمدة 7 أيام على الأقل مع التناوب للسماح بتطور الطب التكميلي والبديل (CAM). يمكن استخدام دوار أوتوماتيكي ، أو يمكن تدوير البيض 180 درجة 2-3 مرات في اليوم.
< p class = "jove_title" >
2. فتح البيض
ملاحظة: يجب أن يتم فتح البيض عندما يكون CAM قد تطور بشكل كامل. يحدث هذا عادة في يوم التطوير 7 أو 8.
- تطهير خزانة السلامة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول. وبالمثل ، قم بتطهير ووضع في خزانة السلامة الحيوية رف بيض ، وشمعة بيض ، وعلامة ، وأداة دوارة لاسلكية مع حجر طحن كربيد السيليكون وعجلة قطع دائرية ، وإبرة 18 جرام ، ووحدة تحكم ماصة مع أنابيب مفرغة بحجم ربع بوصة ، وشريط تعبئة ، ومقص مكتب ، ومقص منحني ، ملقط Semken (أو ما شابه ذلك) ، وكرات قطنية ، وضمادة فيلم شفافة مقاس 6 × 7 سم. كلما أمكن ، استخدم أدوات معقمة أو يمكن التخلص منها أو معقمة.
- قم بإيقاف تشغيل دوار البيض. ضع ما يقرب من 1-3 بيضات في خزانة السلامة الحيوية على رف البيض. أثناء وجودك في الظلام ، ضع شمعة البيض على قشر البيض لتحديد الخلية الهوائية. حدد موقع الخلية الهوائية.
ملاحظه: تعتبر شدة الإضاءة من شمعة البيض أمرا بالغ الأهمية لتصور الجزء الداخلي من البيضة. إذا كان من الصعب رؤية الخلية الهوائية أو الأوعية الدموية باستمرار ، فحاول استبدال بطاريات شمعة البيض.
- حرك شمعة البيض فوق القشرة للعثور على شبكة أوعية دموية كبيرة. قم بتدوير البيضة إذا لزم الأمر. سوف تتفرع الأوعية الدموية المثالية بالقرب من منتصف البويضة. استخدم قلم تحديد للسحب فوق الأوعية الدموية لاستخدامها في الزرع.
- قم بتشغيل الضوء في الغطاء. باستخدام أداة دوارة لاسلكية مزودة بحجر طحن من كربيد السيليكون ، قم بحفر ثقب صغير في الغلاف مباشرة فوق مركز الخلية الهوائية. قم بالحفر حتى تتم إزالة معظم القشرة ، لكن الغشاء الداخلي الأبيض سليم.
ملاحظه: يسمح الحفر فوق الخلية الهوائية قبل استهداف الأوعية الدموية بتحديد سمك قشر البيض هذا فوق الخلية الهوائية بدلا من فوق CAM والأوعية الدموية. إذا تعطل الطب التكميلي والبديل أو الأوعية الدموية ، فلن تكون البويضة قابلة للاستخدام للزرع.
- حفر وافتح حفرة صغيرة أخرى حيث سيتم فتح نافذة الأوعية الدموية كما حدث للخلية الهوائية (الخطوة 2.4).
- باستخدام إبرة 18 جم ، اخترق برفق الغشاء الداخلي الأبيض فوق الخلية الهوائية والأوعية الدموية. إذا لم تتمكن من اختراق القشرة ، فقم بالحفر بعناية أكثر من ذلك بقليل. تأكد من تعطيل الغشاء الداخلي الأبيض (ولكن ليس CAM) في جميع أنحاء المنطقة المحفورة بأكملها. إزالة قطعة الغشاء ليست ضرورية.
ملاحظه: إذا تعطل الطب التكميلي والبديل أو الأوعية الدموية أثناء هذه الخطوة ، فتخلص من البويضة. يتضح الضرر إذا كان هناك دم أو ألبومين يتسرب من حفرة محفورة.
- أطفئ ضوء غطاء المحرك. باستخدام شمعة البيض ، تحقق من نقل الخلية الهوائية من نهاية البويضة إلى المنطقة الموجودة فوق الأوعية الدموية. إذا لزم الأمر، ضع أنبوب التفريغ الذي تم إدخاله في وحدة تحكم الماصة حول الفتحة الموجودة فوق خلية الهواء الأصلية وقم بتطبيق الشفط برفق على دفعات قصيرة لتحريك الخلية الهوائية.
- استخدم علامة لتحديد الموقع الجديد للخلية الهوائية على بعد حوالي 0.5 سم داخل حدود الهواء-CAM. قم بلصق قطعة من شريط التعبئة فوق الخلية الهوائية الجديدة مباشرة. إذا لزم الأمر ، استخدم مقص المكتب القياسي لقص الشريط إلى الحجم المناسب.
ملاحظه: يمكن أن يعطل الشريط تدفق الهواء عبر الغلاف ويجب ألا يكون أكبر من اللازم لتغطية الخلية الهوائية بالكامل.
- أعد البيض إلى الحاضنة لتسخينه دون دوران مع توجيه الخلية الهوائية الجديدة لأعلى. كرر الخطوات 2.2-2.9 لفتح البيض المتبقي.
ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. إذا لم تكن متأكدا من جودة نمو الطب التكسي والبديل ، فيجب أن يمر عدد صغير من البيض من خلال الخطوة 2.16 قبل فتح البيض المتبقي.
- ضع ما يقرب من 1-3 بيضات مع خلايا هوائية منقولة على رف البيض في خزانة السلامة الحيوية.
ملاحظه: يجب توخي الحذر لتجنب إدخال التلوث في البيضة المفتوحة. لذلك ، افتح البيض دائما داخل خزانة السلامة الحيوية ، واستخدم أدوات ومعدات معقمة كلما أمكن ذلك.
- باستخدام أداة دوارة لاسلكية مزودة بعجلة قطع دائرية ، قم بقص خط صغير فوق حدود الخلية الهوائية المرسومة في الخطوة 2.8. تأكد من أن هذا حوالي 0.5 سم داخل حدود الهواء الفعلية CAM لتجنب تعطيل CAM أو الأوعية الدموية. اقطع القشرة تماما ولكن احرص على عدم الاختراق بعمق كاف لتعطيل CAM أو الأوعية الدموية.
- باستخدام مقص منحني ، قم بقص الخلية الهوائية المتبقية لإنشاء نافذة في القشرة.
ملاحظه: إذا كان الدم أو الغشاء موجودا على القشرة التي تمت إزالتها ، فإن البويضة غير مناسبة للزرع. إذا لم يتم فتح نسبة عالية من البيض بشكل نظيف ، ففكر في الانتظار لمدة يوم إضافي واحد على الأقل لفتح البيض المتبقي للسماح بتكوين CAM بشكل أفضل. إذا لم يتم ثقب قشور البيض المتبقي ، فيجب استئناف دوران البيض داخل الحاضنة.
- تحقق من صلاحية الجنين. ستظهر الأجنة القابلة للحياة الأوعية الدموية الواسعة أو الألبومين الصافي أو حركة الجنين أو نبضات قلب مرئية.
- باستخدام ملقط Semken ، اسحب قطعا صغيرة من القطن من كرة قطنية معقمة. امسح سطح CAM برفق لإزالة غبار القشرة والحطام.
ملاحظه: يجب إجراء إزالة الحطام في نفس اليوم الذي يتم فيه فتح البيض.
- قم بتغطية فتحة القشرة بقطعة ربع من ضمادة الفيلم الشفافة مقاس 6 × 7 سم.
- أعد البيض إلى الحاضنة. تأكد من أن البيضة تجلس بإحكام مع توجيه النافذة المفتوحة لأعلى ولا يلمس CAM ضمادة الفيلم الشفافة. استخدم قطعة من رف البيض أو حافة دوار البيض أو أي عنصر مناسب آخر لدعم أي بيض يستمر في التدحرج.
- كرر الخطوات 2.10-2.16 لفتح جميع البيض المتبقي.
ملاحظه: لا يلزم إكمال فتح البويضات في نفس يوم الزرع. يمكن أن يساعد الانتظار لمدة يوم واحد على الأقل في القضاء على البيض الذي تعرضت قابليته للخطر عن طريق فتح القشرة.