نمذجة السرطان القائمة على غشاء المشيمة الدجاج: نموذج داخل البيض لدراسة تكوين أورام الخلايا السرطانية والورم الخبيث

الملخص

المصدر: Sharrow ، A. C. et al. باستخدام نموذج غشاء الدجاج المشيمي في الجسم الحي لدراسة سرطانات أمراض النساء والمسالك البولية. J. Vis. Exp.(2020)

في هذا الفيديو ، نصف زرع الخلايا السرطانية على غشاء المشيمة للدجاج لتوليد نموذج في البيضا. نجح النموذج في تطعيم خلايا سرطان المبيض لدراسة تطور سرطان أمراض النساء.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير تعليق الخلايا السرطانية للزرع (الخيار 1)

ملاحظة: يجب إكمال هذا قبل الزرع مباشرة ، والذي يجب أن يحدث بشكل مثالي بين الأيام 7 و 10. يرجى الاطلاع على الملاحظات في بداية الخطوة 3 أو 4 لمزيد من المعلومات حول تاريخ الزرع. تم استخدام هذا النهج لجميع خطوط الخلايا وهضم ورم سرطان الكلى المزروع.

1. قم بإذابة محلول المصفوفة خارج الخلية على الجليد.
2. باستخدام الهضم الميكانيكي و / أو الأنزيمي ، احصل على تعليق خلية واحدة باستخدام طريقة مناسبة لنوع الخلية التي يتم زرعها.
3. إعادة تعليق العدد الإجمالي للخلايا المراد زرعها في وسط مناسب للزرع. يزرع 1-2 × 10⁶ خلايا لكل بويضة نموذجية.
   ملاحظه: عادة ما تكون الوسيلة المستخدمة لزرع خطوط الخلايا هي الوسط الكامل المستخدم لزراعة الخلايا ، والتي تحتوي على FBS أو استبدال المصل. عادة ما يستخدم زرع هضم الورم الوسط الكامل المستخدم لزراعة خطوط الخلايا من نفس النوع السرطاني. ومع ذلك، يمكن إجراء تعديلات على صيغة الوسيط إذا لزم الأمر تجريبيا. يجب تحديد التأثيرات على تطور الورم ونموه تجريبيا.
4. قم بتكسير الخلايا باستخدام سرعة ووقت أجهزة الطرد المركزي المناسبة للخلايا المستخدمة. السرعات النموذجية هي 250-300 × جم ، والأوقات من 5 إلى 10 دقائق.
5. قم بإزالة المادة الطافية من الخلايا المحببة عن طريق سحب العينات. أعد تعليق الخلايا ميكانيكيا في الوسط المتبقي عن طريق النقر أو سحب العينات. ضعها على الثلج لتبرد. قم بقياس حجم الخلايا والوسط باستخدام ماصة ذات حجم مناسب.
6. احسب أحجام الزرع بحيث يتم زرع 1-2 × 10⁶ خلايا بحجم 20-100 ميكرولتر لكل بويضة بتركيز مصفوفة نهائي خارج الخلية يبلغ 2.7-4 مجم / مل بروتين. أضف وسيطا ، وأي عوامل نمو أو إضافات مرغوبة ، ومحلول مصفوفة خارج الخلية وفقا لهذا الحساب. يحفظ على الثلج حتى يصبح جاهزا للزرع.
   ملاحظه: بالنسبة للحسابات الواردة في الخطوتين 1.3 و 1.6 ، يجب دمج حجم إضافي لا يقل عن نصف البويضة لضمان حجم مناسب لجميع البويضات في المجموعة. لزرع خطوط خلايا سرطان المبيض (أي SKOV3 و ID8) ، تم زرع 10⁶ خلايا لكل بويضة. لزرع خط خلايا سرطان الخلايا الكلوية RENCA ، الخلايا المستنبتة المشتقة من سرطان الخلايا الكلوية البشرية الأولية المهضومة ، وخطوط خلايا سرطان البروستاتا (أي CWR و C4-2 و MyC-CaP) ، وخطوط خلايا سرطان المثانة (أي HT-1376 و T24) ، تم زرع 2 × 10⁶ خلايا.

< p class = "jove_title" >2. تحضير قطع الورم للزرع (الخيار 2)

ملاحظة: يجب إكمال هذا قبل الزرع مباشرة ، والذي يجب أن يحدث بشكل مثالي بين الأيام 7 و 10. يرجى الاطلاع على الملاحظات في بداية الخطوة 3 أو 4 لمزيد من المعلومات حول تاريخ الزرع. تم زرع سرطانات المبيض والمثانة الأولية كقطع ورم.

1. قم بإذابة محلول المصفوفة خارج الخلية على الجليد. خفف إلى تركيز بروتين نهائي من 2.7-4 مجم / مل في وسط مناسب يحتوي على أي عوامل نمو أو إضافات مرغوبة. حافظ على الجليد.
   ملاحظه: عادة ما يستخدم زرع قطع الورم الوسط الكامل المستخدم لزراعة خطوط الخلايا من نفس النوع السرطاني. ومع ذلك، يمكن إجراء تعديلات على صيغة الوسيط إذا لزم الأمر تجريبيا. يجب تحديد التأثيرات على نقش الورم ونموه تجريبيا.
2. باستخدام مشرط أو مقص ، قم باستئصال القطع من الورم الجديد. تتراوح الأحجام المثالية من 2-5 مم على كل جانب. حافظ على المناديل مغمورة في الوسط حتى تصبح جاهزة للزرع.

< p class = "jove_title" >3. الزرع باستخدام حلقة غير لاصقة (الخيار 1)

ملاحظة: يمكن زرع الخلايا بدءا من يوم التطوير 7 إذا تم تطوير CAM بالكامل. يمكن أن يحدث الزرع في أي وقت قبل الفقس مما يسمح بالوقت الكافي لتطور الورم والتجربة المرغوبة ولكن لاحظ أن الخلايا المناعية للجنين تبدأ في الظهور في اليوم العاشر بعد الإخصاب. يختلف معدل نمو الورم اختلافا كبيرا حسب نوع الخلية ويحتاج إلى تحديده تجريبيا لنوع الخلية التي تهمها. تم زرع سرطان المبيض وخلايا سرطان البروستاتا باستخدام طريقة الحلقة غير اللاصقة. لاحظ أنه في حالة عدم توفر حلقة غير لاصقة، يمكن قطع طرف الماصة بحجم مماثل واستخدامه.

1. استخدم 70٪ من الإيثانول لتطهير خزانة السلامة الحيوية وجميع الأدوات المطلوبة: رف بيض ، ملقط قزحية منحني ، حلقات غير لاصقة (قطر داخلي 1/4 بوصة) ، قضيب تحريك زجاجي ، ماصات وأطراف ذات حجم مناسب ، ضمادة فيلم شفافة مقاس 6 × 7 سم ، مقص مكتب ، قلم تحديد أو قلم رصاص. كلما أمكن ، يجب استخدام أدوات معقمة أو يمكن التخلص منها أو معقمة.
2. ضع البيض المراد زرعه على رف البيض في خزانة السلامة الحيوية. حدد عددا يمكن التحكم فيه من البيض. ما يصل إلى ستة نموذجي. تجنب ترك البيض يبرد بشكل كبير أثناء العمل معه.
3. قم بإزالة ضمادة الفيلم الشفافة من القشرة عن طريق لف الحواف باتجاه النافذة المفتوحة لتجنب سحب قطع القشرة. تأكد من أن البيض قابل للحياة وصحي. سيكون للبيض المثالي وعاء كبير في وسط المنطقة المفتوحة مع أوعية أصغر تتفرع منه.
4. باستخدام ملقط القزحية المنحني ، ضع حلقة معقمة غير لاصقة على CAM فوق الوعاء ، من الناحية المثالية فوق نقطة فرعية. استخدم قضيب تقليب زجاجي معقم لتآكل الكاميرا برفق.
5. قم بتثبيت تعليق الخلية من الخطوة 1.6 إلى وسط الحلقة غير اللاصقة. بدلا من ذلك ، استخدم الملقط لوضع قطعة الورم من الخطوة 2.2 في وسط الحلقة غير اللاصقة وتغطيتها ب 20-50 ميكرولتر من محلول المصفوفة خارج الخلية المتولد في الخطوة 2.1.
6. أغلق الفتحة بقطعة ربع من ضمادة الفيلم الشفافة مقاس 6 × 7 سم. قم بتسمية البويضات بتسمية الزرع المناسبة.
   ملاحظه: يسهل ترقيم البيض داخل مجموعة الملاحظات الطولية.
7. أعد البيضة إلى الحاضنة. تأكد من أن فتحة القشرة في وضع مستقيم وأن البيضة آمنة.
   ملاحظه: يمكن إرجاع البيض إلى حاضنة البيض دون دوران. بدلا من ذلك ، يمكن الحصول على جدوى عالية بعد الزرع باستخدام حاضنة خلية 37-38 درجة مئوية مع تعطيل ثاني أكسيد الكربون₂ ومقياس رطوبة لمراقبة الرطوبة ، والتي يجب أن تكون 50٪ -80٪.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 010 تفلون (PTFE) أبيض 55 Duro Shore D O خواتم متجر O-Ring تاف 010 حلقة غير لاصقة لبذر الخلايا. 1/4 "معرف X 3/8" OD X 1/16 "CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). مقص التشغيل الدقيق. منحني; حاد حاد. طول الشفرة 30 مم ؛ 4-3 / 4 بوصة. الطول الكلي روبوز الجراحي RS6703 هذا مقدم كمثال. أي مقص منحني مماثل سيعمل أيضا. مجموعة أدوات Dremel 8050-N / 18 Micro 8V Max دريميل 8050-N/18 تحتوي هذه المجموعة على جميع الأدوات اللازمة بيض الدجاج المخصب (رود آيلاند أحمر - بني ، درجة مختبر) شركة AA Lab Eggs Inc. غير متاح يجب تحديد مورد البيض المحلي ، لأن هذا المورد يسلم إقليميا فقط. Hovabator Genesis 1588 مجموعة كومبو حاضنة البيض الفاخرة مستودع الحاضنة HB1588D لا شيء - 1102-1588-1357 يمكن استخدام حاضنات بيض أخرى ، ولكن يجب التحقق من موثوقيتها. بعد الزرع ، يمكن أيضا استخدام حاضنة خلية مع تعطيل ثاني أكسيد الكربون. Incu-Bright كول لايت بيض كاندلر مستودع الحاضنة 1102 يمكن استخدام شموع أخرى ؛ ومع ذلك ، يفضل هذا من بين تلك التي اختبرناها. يتم تضمين هذه الشمعة في مجموعة الحاضنة المذكورة أعلاه. ماتريجيل غشاء مصفوفة HC; خالية من LDEV كورنينج 354248 حل مصفوفة خارج الخلية سكوف 3 ATCC إتش تي بي-77 خط خلايا سرطان المبيض البشري. قضبان التحريك مع شرطي مطاطي ؛ قطر 5 مم ، 6 بوصات. الطول اللوازم العلمية المتحدة جي بي إل 06 هذا مقدم كمثال. أي قضبان تحريك زجاجية مماثلة ستعمل أيضا. ملقط العينة علوم المجهر الإلكتروني 72914 هذا مقدم كمثال. يبلغ طول الملقط المستخدم لسحب الغلاف بعيدا للتصوير الحيوي حوالي 12.8 سم مع أطراف بعرض 3 مم.