اختبار Agarose Spin Down: تقنية لتضمين العضيات للتحليل النسيجي

الملخص

المصدر: Lee، S. et al. إنشاء وتحليل العضيات ثلاثية الأبعاد (3D) المشتقة من عينات النقائل العظمية لسرطان البروستاتا للمريض وطعومها الغريبة. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نقوم بإجراء اختبار دوراني لتضمين عضيات سرطان البروستاتا ثلاثية الأبعاد في agarose. يمكن استخدام هذه العضيات المدمجة لمزيد من التحليل النسيجي المرضي لدراسة نمو السرطان وتطوره.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. المعالجة العضوية لعلم الأنسجة: طريقة Agarose Spin Down

ملاحظة: تم اقتباس هذا البروتوكول من منشور سابق بواسطة Vlachogiannis et al. لقد أضفنا خطوة تتضمن تضمين الاغاروز لتضمين جميع مجموعات العضيات بنجاح.

1. قم بإزالة الوسائط الموجودة من البئر. احرص على عدم شفط قباب الغشاء القاعدي.
2. أضف حجما متساويا (يساوي حجم الوسائط التي تمت إزالتها من الخطوة 1) لمحلول استعادة الخلية واحتضنه لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
قم
3. بإزاحة قبة الغشاء القاعدي باستخدام ماصة وسحق قبة الغشاء القاعدي باستخدام طرف ماصة. اجمع القبة المنفصلة ومحلول استعادة الخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل.
4. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
5. قم بإزالة المادة الطافية (محلول استعادة الخلايا). احفظ جميع المواد الطافية في أنابيب منفصلة حتى النهاية ، عندما يتم تأكيد وجود العضيات في خطوة التكوير النهائية.
6. أضف الحجم المطلوب (الجدول 1) من PBS البارد وقم بالماصة برفق لأعلى ولأسفل لإزعاج الحبيبات ميكانيكيا.
7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
8. قم بإزالة المادة الطافية (PBS).
9. قم بتثبيت الحبيبات بحجم متطابق (على سبيل المثال ، 500 ميكرولتر لحبيبات واحدة من حالة زراعة الألواح المكونة من 24 بئرا ، الجدول 1) بنسبة 4٪ PFA لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
10. بعد التثبيت ، جهاز الطرد المركزي عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
11. قم بإزالة المادة الطافية (PFA).
12. يغسل بحجم متطابق (على سبيل المثال ، 500 ميكرولتر لحبيبات واحدة من حالة زراعة الألواح المكونة من 24 بئرا ، الجدول 1) من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
13. تحضير الاغاروز الدافئ (2٪ الاغاروز في PBS).
    ملاحظه: هنا, يمكن إعادة تعليق الكريات الخلوية للأقسام المجمدة مباشرة في 200 ميكرولتر من مركب OCT.
14. أعد تعليق حبيبات الخلية في 200 ميكرولتر من الاغاروز (2٪ في PBS).
    1. مباشرة بعد إضافة agarose ، افصل حبيبات الخلية برفق عن جدار أنبوب 1.5 مل باستخدام إبرة 25 جم متصلة بحقنة 1 مل. كما هو موضح في الشكل 1, إذا لم يتم فصل حبيبات الخلية جسديا عن جدار الأنبوب 1.5 مل, ثم هناك خطر فقدان كل أو جزء من حبيبات الخلية أثناء عملية تضمين الاغاروز.
15. انتظر حتى يتم ترسيخ 2٪ agarose في PBS تماما.
16. افصل كتلة الاغاروز الصلبة عن أنبوب 1.5 مل باستخدام إبرة 25 جم متصلة بحقنة 1 مل.
17. انقل كتلة الاغاروز المنفصلة التي تحتوي على حبيبات الخلية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
18. املأ الأنبوب بنسبة 70٪ EtOH واستمر في استخدام البروتوكول التقليدي لتجفيف الأنسجة وتضمين البارافين.

الجدول 1: كثافة البذر وحجم الغشاء القاعدي والحجم المتوسط اللازم لقبة واحدة

لوحة الثقافة كثافة البذر (الخلايا) حجم الغشاء القاعدي (ميكرولتر) متوسط (ميكرولتر) 48 حسنا 25,000-50,000 20 250 حيا 24 حسنا 50,000-250,000 40 500 جنيه 6 حسنا 50,000-250,000 40 2,000

النتائج

الشكل 1: خطوة أساسية لتضمين الاغاروز الناجح. عملية لفصل حبيبات الخلية عن جدار أنبوب 1.5 مل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 مل بيبيتمان جيلسون F123602 1 مل حقنة حقنة BD 329654 أنبوب 1.5 مل منتجات مختبر الطيف 941-11326-ATP083 إبرة 25 جرام إبرة BD PrecisionGlide 305122 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) ألفا إيسار J61899 70٪ إيثانول (EtOH) VWR BDH1164-4 لب أغاروز لونزا 50000 لوحة زراعة الخلية - 24 بئر كوستار 3524 لوحة ثقافة الخلية - 48 بئر كوستار 3548 لوحة ثقافة الخلية - 6 بئر كوستار 3516 حل تفكك الخلايا ، Accumax شركة Innovative Cell Technologies، Inc. AM105 حل استعادة الخلايا كورنينج 354253 مكشطة الخلية سارستيدت 83.18 دولار موصل البيانات التفاعلية كورنينج / سيلجرو 21-031-السيرة الذاتية أطراف الماصة 1 مل (أطراف زرقاء) فيشربراند ريدي تيب 21-197-85 جهاز طرد مركزي صغير أعلى الطاولة ثيرموفيشر العلمي 75002426 كمبوند OCT الأنسجة تيك 4583 حمام مائي فيشر إس سي 2320