الفحص العضوي للبروستاتا: تقنية ثقافة خارج الجسم الحي القائمة على حلقة هلام المصفوفة لدراسة قدرة التمايز لخلايا ظهارة البروستاتا

الملخص

المصدر: Crowell، P.D. et al. تقييم قدرة التمايز لخلايا ظهارة البروستاتا في الفأر باستخدام الثقافة العضوية. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح استزراع الخلايا الظهارية للبروستاتا المعزولة باستخدام تقنية الثقافة القائمة على حلقة الهلام المصفوفة. يمكن أن يوفر هذا النهج معلومات تكميلية حول قدرة التمايز للخلايا الظهارية في البروستاتا لتشكيل هياكل غدية ثلاثية الأبعاد استجابة للتلاعب الجيني أو الدوائي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. طلاء الخلايا الظهارية للبروستاتا المصنفة في ثقافة العضوية الأولية للفأر - التوقيت: 2-3 ساعة (باستثناء تحضير الألواح المطلية ب Poly-HEMA)

< p class = "jove_content" >ملاحظة: الألواح مطلية ب Poly-HEMA لمنع تكوين مستعمرة ثنائية الأبعاد على سطح البئر أسفل هلام المصفوفة. قم بإعداد الألواح المطلية ب Poly-HEMA قبل يوم واحد من الطلاء ، فرز الخلايا الظهارية القاعدية أو اللمعية للبروستاتا في مزرعة العضوية للفأر. قم بإذابة 1 مل من هلام مصفوفة عامل النمو المنخفض ، المشار إليه فيما يلي باسم هلام المصفوفة ، على الثلج قبل ساعتين من الخطوة 1.1. يجب إضافة Y-27632 (مثبط الصخور) إلى الوسائط العضوية للفأر مباشرة قبل الخطوة 1.1. قم بتنفيذ الخطوات 1.1-1.8 على الجليد.

1. قم بتكسير الخلايا في 5 مل من الأنابيب المستديرة القاع عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية.
2. اغسل حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من الوسائط العضوية للفأر (الجدول 1).
3. قم بتحبيير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية.
4. يعاد تعليقه في الوسائط العضوية للفأر بكثافة خلية تبلغ 1,000 خلية / ميكرولتر.
5. لتحضير الخلطات الرئيسية ، امزج الخلايا الظهارية المعلقة في الوسائط العضوية للفأر مع هلام المصفوفة لتوليد خليط نهائي يحتوي على 25٪ خلايا / وسائط و 75٪ هلام مصفوفة. عادة ما يتم طلاء الخلايا القاعدية بتركيز 100-2000 خلية / 80 ميكرولتر ، في حين أن الخلايا اللمعية عادة ما تكون مطلية بتركيز 2000-10000 خلية / 80 ميكرولتر. تختلف كثافة الخلايا المطلية اعتمادا على يوم جمع المواد المتوقع والتطبيق النهائي المطلوب.
   ملاحظة: قم بتبريد الأنبوب (الأنبوب) بحجم مناسب للخلط الرئيسي المتوقع قبل 5 دقائق من تحضير المزيج الرئيسي. لضمان عدم تصلب هلام المصفوفة أثناء المناولة ، من الضروري تبريد طرف الماصة عن طريق سحب هلام المصفوفة 3-4 مرات قبل نقله إلى أنبوب جديد.
6. أضف 80 ميكرولتر من خليط هلام المصفوفة / الخلية لكل بئر من صفيحة 24 بئرا. يوصى بسحب قطرة على النصف السفلي من جدار البئر ، مع تجنب الاتصال المباشر بطلاء Poly-HEMA. بعد إضافة هلام المصفوفة ، قم بتدوير اللوحة للسماح لخليط هلام المصفوفة / الخلية بتشكيل حلقة حول حافة البئر.
7. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ على الجانب الأيمن لأعلى لمدة 10 دقائق للسماح لهلام المصفوفة بالتصلب جزئيا.
   ملاحظة: ابدأ في تسخين الوسائط العضوية للفأر عند 37 درجة مئوية مباشرة بعد وضع اللوحة المكونة من 24 بئرا في الحاضنة.
8. بعد الحضانة لمدة 10 دقائق ، اقلب اللوحة المكونة من 24 بئرا رأسا على عقب واحتضانها لمدة 50 دقيقة إضافية للسماح لهلام المصفوفة بالتصلب تماما.
9. أضف 350 ميكرولتر من الوسائط العضوية للفأر المسخنة مسبقا بالتنقيط إلى وسط كل بئر.
   ملاحظة: للحفاظ على سلامة هلام المصفوفة ، من الأهمية بمكان تجنب حلقة هلام المصفوفة أثناء إضافة الوسائط.
10. بعد إضافة الوسائط ، أعد اللوحة المكونة من 24 بئرا إلى حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO₂.

< p class = "jove_title" >2. تجديد الوسائط العضوية للفأر - التوقيت: 10-15 دقيقة لكل طبق 24 بئرا

ملاحظة: يجب استبدال الوسائط الحالية بوسائط جديدة كل 48 ساعة. قبل كل تغيير في الوسائط ، قم بتسخين الوسائط العضوية للفأر مسبقا. ليس من الضروري إضافة مثبط ROCK إلى الوسائط المستخدمة للتجديد.

1. قم بإمالة اللوحة المكونة من 24 بئرا بزاوية 45 درجة وقم بإزالة الوسائط الموجودة برفق من مركز كل بئر باستخدام ماصة P1000 مع تجنب حلقة هلام المصفوفة.
2. أضف 350 ميكرولتر من الوسائط العضوية للفأر المسخنة مسبقا كما في الخطوة 1.9. يوصى بإضافة كمية أكبر من الوسائط (حتى 1 مل) إلى العضيات المستزرعة لمدة تزيد عن 5 أيام لمنع الاستنفاد السريع للعناصر الغذائية الرئيسية وعوامل النمو.

الجدول 1: تعليمات لإعداد الوسائط العضوية للفأر

مكون

تركيز

ب -27 1x (خفف من تركيز 50x) جلوتاماكس 1x (مخفف من تركيز 100x) ن-أسيتيل-L-سيستين 1.25 ملي نورموسين 50 ميكروغرام / مل EGF البشري المؤتلف ، خال من 50 نانوغرام / مل مؤتلف الإنسان نوجين 100 نانوغرام / مل R-spondin 1-الوسائط المكيفة 10٪ وسائط مكيفة أ 83-01 200 نانومتر DHT 1 نانومتر Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد (مثبط ROCK) 10 ميكرومتر متقدم DMEM / F-12 الوسائط الأساسية R-spondin 1-conditioned is is generated كما هو موضح في Drost et al. بعد إضافة جميع المكونات ، قم بتصفية تعقيم الوسائط العضوية للفأر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. يضاف مثبط ROCK فقط أثناء إنشاء الثقافة ومرور العضيات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيغما F8667 مكمل B-27 (50x) ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي 17504044 متقدم DMEM / F-12 ثيرمو فيشر العلمي 12634010 طبق μ 35 مم ، ارتفاع المرجع نفسه 81156 ماتريجل GFR مصفوفة غشاء كورنينج سي بي -40230 ج البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ثيرمو فيشر العلمي 15-140-122 بولي (2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات) (بولي هيما) سيغما P3932-25G Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد (مثبط ROCK) سيليك للكيماويات S1049-50 ملغ أ 83-01 توكرس 2939 (ديهيدرو) التستوستيرون (5αAndrostan-17β-ol-3-one) سيغما أ -8380 جلوتاماكس ثيرمو فيشر العلمي 35050061 نورموسين ثيرمو فيشر العلمي النمل رقم 1 EGF البشري المؤتلف ، خال من بيبروتك AF-100-15 مؤتلف الإنسان نوجين بيبروتك 120-10 درجة مئوية RPMI 1640 متوسط، HEPES (CS من 10) ثيرمو فيشر العلمي 22400105 وقف مثبطات الفوسفاتيز ثيرمو فيشر العلمي 78428 كوكتيل كامل مثبط البروتياز سيغما 11836145001 تريتون X-100 سيغما X100-5 مل سونيك ديمبراتور ثيرمو فيشر العلمي FB120