استخراج محللات البروتين: تقنية لتحلل العضيات لجمع البروتينات الخلوية

الملخص

المصدر: Crowell، P.D. et al. تقييم قدرة التمايز لخلايا ظهارة البروستاتا في الفأر باستخدام الثقافة العضوية. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح استخراج محللات البروتين من عضيات البروستاتا المزروعة في حلقة مصفوفة غشاء القاعدي. يمكن أن يساعد تحليل كسور البروتين المستخرجة في دراسة تعبير علامة النسب في العضيات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. استخراج محللة البروتين من عضيات البروستاتا لتحليل اللطخة الغربية - التوقيت: 2.5-4 H

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قبل جمع العضيات لاستخراج محللات البروتين ، قم بإعداد الوسائط المحتوية على التباين وتسخينها مسبقا (الجدول 1).

1. قم بإزالة الوسائط من كل بئر عن طريق إمالة الصفيحة المكونة من 24 بئرا بزاوية 45 درجة وإزالة الوسائط الموجودة برفق من مركز كل بئر باستخدام ماصة P1000 مع تجنب حلقة هلام المصفوفة.
2. لجمع العضيات ، قم بتفجير هلام المصفوفة بشكل متكرر عن طريق سحب 1 مل من الوسائط المحتوية على التباين مباشرة على حلقة هلام المصفوفة حتى يتم إزاحة الحلقة بأكملها ، ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. < / > ملاحظة: من الأهمية بمكان تجنب الاتصال المباشر بالآبار المطلية ب Poly-HEMA. قد يتسبب الاتصال المباشر في تلوث المواد التي تم جمعها ب Poly-HEMA ، مما قد يؤثر سلبا على بقاء الخلية.
3. ضع أنبوب (أنبوب) أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة للسماح بالهضم الكامل لهلام المصفوفة عن طريق الاختلاف.
4. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند RT وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة.
5. أضف المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى الحبيبات العضوية وأعد تعليقه عن طريق النقر برفق. < / > ملاحظة: قد يؤدي الفشل في إعادة تعليق الحبيبات العضوية بشكل كاف إلى تلوث المواد العضوية ب التباعد المتبقي أو هلام المصفوفة.
6. قم بتحبيب العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند RT وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة.
قم
7. بتجميد الكريات العضوية بسرعة عن طريق وضع كل أنبوب في محلول يحتوي على الثلج الجاف والميثانول. قم بتخزين الأنبوب (الأنبوب) حتى الاستخدام المستقبلي عند -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك ، استخرج محللات البروتين مباشرة بعد الخطوة 1.6.
8. أعد تعليق الكريات العضوية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل البروتين (الجدول 1) لكل 10 ميكرولتر من حجم الخلية المعبأة. انقر فوق التمرير للتعليق.
   ملاحظة: في حالة الاستئناف بعد التجميد السريع ، تأكد من إذابة المخزن المؤقت لتحلل البروتين قبل إزالة العينات من -80 درجة مئوية ، حيث يجب إضافة محلول التحلل إلى العينات على الفور لمنع نشاط الفوسفاتيز والبروتياز.
9. احتضان العينات في مخزن تحلل البروتين المؤقت على الجليد لمدة 45 دقيقة على الأقل.
   ملاحظة: يوصى بالصوتنة قبل الحضانة على الجليد لزيادة كفاءة استعادة البروتين النووي. ومع ذلك ، فإن الصوتنة ليست مطلوبة. إذا لم يتم إجراء صوتنة ، فانتقل إلى الخطوة 1.10.
   1. للصوتنة ، اغمر الأنابيب في الثلج الرطب وقم بتطبيق طرف جهاز التفريغ الصوتي برفق على أنبوب الطرد المركزي الدقيق. Sonicate لمدة 40 ثانية عند 20 كيلو هرتز.
10. انتقل إلى اللطخة الغربية باتباع البروتوكولات المعمول بها.

الجدول 1: تعليمات لإعداد الحلول الرئيسية

وصفات الوسائط المحتوية على التباين 1 مجم / مل ديسبيز + 10 ميكرومتر مثبط ROCK في DMEM F12 المتقدم. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. وسائط التفكك 10٪ FBS + 1x بنسلين ستربتومايسين في RPMI 1640. تعقيم الفلتر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. عازلة تحلل البروتين RIPA Buffer + مثبطات الفوسفاتيز + مثبطات البروتياز حجب الحل 10٪ FBS في PBS مع 0.2٪ Triton X-100

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أ 83-01 توكرس 2939 متقدم DMEM / F-12 ثيرمو فيشر العلمي 12634010 مكمل B-27 (50x) ، خال من المصل ثيرمو فيشر العلمي 17504044 Dispase II ، مسحوق ثيرمو فيشر العلمي 17-105-041 مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيغما F8667 جلوتاماكس ثيرمو فيشر ساينتيك 35050061 وقف مثبطات الفوسفاتيز ثيرمو فيشر العلمي 78428 ماتريجل GFR مصفوفة غشاء كورنينج سي بي- 40230 ج ن-أسيتيل-L-سيستين سيغما أ 9165 نورموسين ثيرمو فيشر العلمي النمل رقم 1 البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / < / > مل) ثيرمو فيشر العلمي 15-140-122 بولي (2-هيدروكسي إيثيل ميثاكريلات) < br / > (بولي هيما) سيغما P3932-25G مقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي
(ريبا) ثيرمو فيشر العلمي PI89901 المؤتلف EGF البشري ، AnimalFree بيبروتك AF-100-15 مؤتلف الإنسان نوجين بيبروتك 120-10 درجة مئوية RPMI 1640 متوسط, HEPES (cs of
10) ثيرمو فيشر العلمي 22400105 سونيك ديمبراتور ثيرمو فيشر العلمي FB120 تريتون X-100 سيغما X100-5 مل Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد (مثبط ROCK) سيليك للكيماويات S1049-50 ملغ