مقالة منهجية

التصوير المناعي الكامل: تقنية التثبيت والتلوين لتقييم العضيات السليمة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Crowell، P.D. et al. تقييم قدرة التمايز لخلايا ظهارة البروستاتا في الفأر باستخدام الثقافة العضوية. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو تقنية تلطيخ الفلورسنت المناعي لعضيات سرطان البروستاتا السليمة وتصويرها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر الكامل. تهدف هذه التقنية إلى تقييم قدرة التمايز خارج الجسم الحي لخلايا البروستاتا الظهارية القاعدية واللمعة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تثبيت وتلطيخ عضيات البروستاتا للتحليل الكيميائي المناعي عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر

  1. جمع عضيات البروستاتا من 24 لوحة بئر - التوقيت: 45-60 دقيقة < / > ملاحظة: عند جمع عضيات البروستاتا لمعالجتها للفحص المجهري متحد البؤر ، من الأهمية بمكان التعامل معها بعناية من أجل الحفاظ على بنيتها. تم تصميم بروتوكول التجميع أدناه لتقليل اضطراب الهيكل العضوي أثناء العزل.
    1. قم بإزالة الوسائط من كل بئر من اللوحة التي تحتوي على عضيات عن طريق إمالة اللوحة بزاوية 45 درجة.
    2. هضم هلام المصفوفة عن طريق احتضانه ب 500 ميكرولتر من الوسائط المحتوية على التباين (الجدول 1) لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO2.
    3. اجمع المعلق العضوي المهضوم في أنبوب الطرد المركزي الدقيق وحبيبات العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية.
  2. تلطيخ الفلورسنت المناعي الكامل لعضيات البروستاتا - التوقيت: 3-4 أيام (1-5 ساعات / يوم)
    1. أضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS واحتضانه لمدة ساعتين في RT مع رج لطيف.
    2. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ب 1 مل من PBS لمدة 15 دقيقة مع رج لطيف.
    3. اغسل الحبيبات كما في الخطوة 1.2.2 مرتين إضافيتين.
    4. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية. أضف 1 ميكروغرام / مل DAPI في محلول الحجب (الجدول 1). احتضن لمدة ساعتين في RT أو بدلا من ذلك طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
    5. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية. أضف الجسم المضاد الأساسي (أرنب مضاد ل p63 ، فأر مضاد للسيتوكيراتين 8) في محلول مانع واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
    6. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل الحبيبات ب 1 مل من PBS لمدة 15 دقيقة مع رج لطيف.
    7. اغسل الحبيبات كما في الخطوة 1.2.6 مرتين إضافيتين.
    8. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية. أضف الجسم المضاد الثانوي (الماعز المضاد للأرانب IgG-Alexa Fluor 594 ، الماعز المضاد للفأر IgG-Alexa Fluor 488) في محلول مانع واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع رج لطيف.
    9. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واغسل الحبيبات ب 1 مل من PBS لمدة 15 دقيقة مع رج لطيف.
    10. اغسل الحبيبات كما في الخطوة 1.2.9 مرتين إضافيتين.
< p class = "jove_title" >2. تطهير الأنسجة وتركيب عضيات البروستاتا الملطخة للفحص المجهري متحد البؤر بالكامل - التوقيت: 7 ساعات

  1. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية.
  2. أضف 1 مل من السكروز بنسبة 30٪ في PBS مع 1٪ Triton X-100 واحتضانه لمدة ساعتين في RT مع رج لطيف.
  3. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية.
  4. أضف 1 مل من السكروز بنسبة 45٪ في PBS مع 1٪ Triton X-100 واحتضنه لمدة ساعتين في RT مع رج لطيف.
  5. قم بتكبيل العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق في RT وقم بإزالة المادة الطافية.
  6. أضف 1 مل من السكروز بنسبة 60٪ في PBS مع 1٪ Triton X-100 واحتضانه لمدة ساعتين في RT مع رج لطيف.
  7. قم بتقطيع العضيات عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 3 دقائق عند RT وقم بإزالة 95٪ من المادة الطافية
    ملاحظة: تصبح الحبيبات أكثر مرونة مع ارتفاع تركيز السكروز. يوصى بمراقبة العضيات الملطخة ب DAPI تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية للتأكد من أنها لم تضيع أثناء إزالة المادة الطافية.
  8. انقل قطرة 10-20 ميكرولتر من المعلق المتبقي إلى غطاء غرفة وانتقل إلى الفحص المجهري متحد البؤر.
    ملاحظة: يمكن وضع شظايا الغطاء على جانبي القطرة لاستخدامها كفواصل (الشكل 1C). هذه تمنع العضيات من الانهيار عند وضع غطاء فوق القطرة.

الجدول 1: تعليمات لإعداد الحلول الرئيسية

مكون تركيز ب -27 1x (خفف من تركيز 50x) جلوتاماكس 1x (مخفف من تركيز 100x) ن-أسيتيل-L-سيستين 1.25 ملي نورموسين 50 ميكروغرام / مل EGF البشري المؤتلف ، خال من 50 نانوغرام / مل مؤتلف الإنسان نوجين 100 نانوغرام / مل R-spondin 1-الوسائط المكيفة 10٪ وسائط مكيفة أ 83-01 200 نانومتر DHT 1 نانومتر Y-27632 ثنائي هيدروكلوريد (مثبط ROCK) 10 ميكرومتر متقدم DMEM / F-12 الوسائط الأساسية R-spondin 1-conditioned is generated as هو موضح في Drost ، وآخرون. بعد إضافة جميع المكونات ، قم بتصفية تعقيم الوسائط العضوية للفأر باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. يضاف مثبط ROCK فقط أثناء إنشاء الثقافة ومرور العضيات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تحليل تعبير علامة النسب في عضيات البروستاتا عن طريق اللطخة الغربية والفحص المجهري متحد البؤر الكامل.(أ) صور تباين الطور التمثيلي للعضيات المشتقة من القاعدة (العلوي) والمشتقة من اللمعة (السفلية) بعد 7 أيام من الاستزراع. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (ب) تحليل اللطخة الغربية للعضيات المشتقة من القاعدة (Bas) والمشتقة من اللمعة (Lum) بعد 5 أيام من الاس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 16٪ بارافورمالدهيد ثيرمو فيشر العلمي 50-980-487 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) ثيرمو فيشر العلمي د1306 متقدم DMEM / F-12 ثيرمو فيشر العلمي 12634010 Dispase II ، مسحوق ثيرمو فيشر العلمي 17-105-041 مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيغما F8667 الماعز المضاد للفأر IgG-Alexa Fluor 488 إنفيتروجين أ 28175 الماعز المضادة للأرانب IgG-Alexa Fluor 594 إنفيتروجين أ 11012 الفأر المضاد للسيتوكيراتين 8 بيو ليجند 904804 البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) ثيرمو فيشر العلمي 15-140-122 أرنب مضاد ل p63 بيو ليجند 619002 RPMI 1640 متوسط، HEPES (CS من 10) ثيرمو فيشر العلمي 22400105 سكروز سيغما S0389-500G تريتون X-100 سيغما X100-5 مل

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DAPI

مقالات ذات صلة