$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ملاحظة: يصف هذا البروتوكول عزل خلايا HT-29 (خط خلايا سرطان القولون البشري) من PBS أو من الخلائط الاصطناعية لخلايا HT-29 والدم المحيطي. تم إجراء نفس التجربة باستخدام خطين خلويين إضافيين (LNCaP و VCaP) ويمكن إجراؤها نظريا مع جميع الخلايا التي تعبر عن EpCAM.
< p class = "jove_title" >
1.
تحضير الخلايا المستهدفة
- زراعة الخلايا ووضع العلامات على الخلايا
ملاحظه: في هذا البروتوكول ، يتم زراعة الخلايا في قوارير استزراع 75 سم مربع. يرجى ضبط كميات الكواشف وفقا لذلك إذا تم استخدام أجهزة زراعة الخلايا الأخرى (على سبيل المثال ، أطباق مزرعة 25 سم مربع ، وأطباق 6 آبار ، وما إلى ذلك). يتم تسخين جميع السوائل المستخدمة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. إذا لم يذكر خلاف ذلك ، يتم تنفيذ جميع خطوات البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (RT).
- زراعة خلايا HT-29 في الوسط المعدل 5a من McCoy مع 2 ملي مولار L-glutamine و 20 ملي مولار Hepes و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في جو 5٪ CO2.
- عندما تكون الخلايا متقاربة بنسبة 90٪ ، قم بإزالة الوسط وشطف الخلايا ب 10 مل من 1x PBS.
- لحصاد الخلايا ، أضف 2 مل من محلول انفصال الخلية (جدول المواد والكواشف) إلى الخلايا واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق تقريبا عند 37 درجة مئوية < br / >
ملاحظه: يحتوي محلول الانفصال على إنزيمات محللة للبروتين ومحللة للكولاجينات في 1x PBS ، و 0.5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 3 مجم / لتر من الفينول الأحمر. قلل وقت التسخين المسبق لمحلول انفصال الخلية إلى الحد الأدنى حيث سيكون هذا غير نشط بعد ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم بتغطية طبقة الخلية بأكملها للحصول على انفصال الخلية الأمثل.
- تحقق من انفصال الخلايا باستخدام مجهر مقلوب.
- انقل جميع الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 50 مل مملوء مسبقا ب 10 مل من وسط زراعة الخلايا (كما هو مستخدم في الخطوة 1.1.1) وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات.
- ضع تعليق الخلية المتبقي على خلاط أسطواني أفقي عند RT وانتقل إلى خطوة وضع العلامات.
- تصنيف الخلايا الحية للخلايا المستهدفة
- قم بتخفيف 1 ميكرولتر من 5 ملي مولار CFSE (يتم توفيره في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ، DMSO) في 1 مل من 1x PBS تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية للحصول على محلول وضع العلامات CFSE الجاهز للاستخدام 5 ميكرومتر.
ملاحظه: للحصول على أفضل نتائج التلوين ، استخدم المحاليل المعدة حديثا.
- قم بإعداد محلول تلطيخ الحمض النووي جاهز للاستخدام (جدول المواد والكواشف) في 1x PBS وتخزينه عند 2-6 درجات مئوية محمي من الضوء.
ملاحظه: للحصول على أفضل نتائج التلوين ، استخدم المحاليل المعدة حديثا.
- احصل على الخلايا من الخلاط الأسطواني الأفقي (الخطوة 1.1.6.) وحبيبات الخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من 1x PBS.
- اشطف الخلايا مرة أخرى باستخدام 1x PBS وأعد تعليق حبيبات الخلية في محلول وضع العلامات CFSE جاهز للاستخدام سعة 500 ميكرولتر.
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة واجمع الخلايا بعد الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق.
- أعد تعليق الخلايا المسماة في 1 مل من وسط زراعة الخلايا الدافئ مسبقا واسمح للخلايا بالتجدد عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق وأعد تعليق كريات الخلية في 1 مل من محلول تلطيخ الحمض النووي الجاهز للاستخدام عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتكسير الخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في 4 مل من 1x PBS. قم بتقييم كثافة الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم وتحقق من وضع العلامات الفلورية باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ومرشحات الفلورسين إيزوثيوسيانات (FITC) (الشكل 1 أ و 1 ه).
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 3 دقائق وأعد تعليق حبيبات الخلية وفقا لكثافة الخلايا اللازمة للتجربة المعنية كما هو موضح في القسم التالي وضعها على الجليد.
فئة
2. شحن السلك
ملاحظة: يمكن عزل الخلايا عن الخلايا المستهدفة / حلقات الدم المحيطية على مقياس المليلتر أو عن طريق توفير عدد منخفض من الخلايا بمقياس ميكرولتر. في حين أن النهج الأول يسمح بمحاكاة حالات الخلايا النادرة في الدم المحيطي ، فقد يكون الأخير هو الطريقة المفضلة لإرفاق عدد قليل من الخلايا لغرض تحسين / اختبار البروتوكول.
- شحن السلك باستخدام كمية كبيرة من معلقات الخلية
- قم بإعداد محلول حجب BSA بنسبة 2٪ عن طريق إذابة 0.8 جم من BSA في 40 مل من 1x PBS (استخدام ثقافة الخلايا). قم بإذابة BSA عن طريق الدوامة الأولية والحضانة اللاحقة في RT على خلاط أسطواني أفقي لمدة 10-20 دقيقة.
- اشطف أنابيب EDTA الفارغة / أنابيب هيبارين الصوديوم ب 2 مل من 2٪ BSA لإزالة بقايا مضادات التخثر والتخلص من المحلول. قم بسد سطح الأنبوب عن طريق الحضانة في RT باستخدام 5 مل من 2٪ BSA على خلاط أسطواني أفقي عند 15 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة وتخلص من المحلول.
- قم بتخفيف الخلايا المسماة (القسم 1.2.) بكثافة 100,000 خلية / مل واستخدم 5 مل لشحن السلك.
- أضف 5 مل من تعليق الخلية المسمى (500,000 خلية في المجموع) إلى الأنبوب. تجنب الفقاعات عند إضافة تعليق الخلية.
- قم بإزالة السلك من حجرة التخزين وكذلك الغطاء المطاطي الذي يحمل السلك واشطفه في 1x PBS (الشكل 2).
- اخترق غطاء الأنبوب المطاطي لأنبوب EDTA (الخطوة 2.1.4) بمساعدة إبرة حقنة (20 جم) وأدخل السلك بحيث يتم غمر الجزء الوظيفي بالكامل في تعليق الخلية عندما يعود الغطاء إلى الأنبوب ويوضع الأنبوب على خلاط الأسطوانة المائل.
ملاحظه: يجب تغطية الجزء الوظيفي الحلزوني الثلاثي من السلك بتعليق خلوي طوال فترة الشحن.
- قم بتدوير الأنابيب على خلاط أسطواني مائل عند 5 دورات في الدقيقة لمدة 30 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق بالسلك.
- اشطف السلك ب 5 مل 1x PBS وقم بتخزينه في الظلام عند 2-6 درجة مئوية في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 1x PBS حتى الفحص البصري.
ملاحظه: يجب دائما غمر الجزء الوظيفي من السلك في PBS لتجنب الإضرار بالخلايا.
- عزل الخلايا المستهدفة من الخلائط الاصطناعية بالدم المحيطي (طريقة الشحن البديلة إلى: 2.1. شحن السلك باستخدام كمية كبيرة من معلقات الخلية)
- قم بتخفيف الخلايا المسماة (القسم 1.2) للحصول على معلقات خلوية ذات كثافة خلوية عالية (> 1،000،000 خلية / مل) ، وبالتالي الحفاظ على حجم تعليق الخلية المضاف إلى الدم المحيطي منخفضا.
- أضف 500 إلى 500,000 خلية إلى 5 مل من الدم المحيطي واخلطها عن طريق قلب الأنبوب.
- قم بإزالة السلك من حجرة التخزين ، وقم بإزالة الغطاء المطاطي الذي يحمل السلك واشطفه في 1x PBS.
- اخترق غطاء أنبوب جديد بالجزء غير الوظيفي من الجهاز باستخدام إبرة حقنة (20 جم) بحيث يتم غمر الجزء الوظيفي بالكامل في الدم المسنن عندما يعود الغطاء إلى الأنبوب ويتم وضع الأنبوب على الخلاط الأسطواني المائل
ملاحظه: يجب تغطية الجزء الوظيفي الحلزوني الثلاثي من السلك بتعليق خلوي طوال فترة الشحن.
- احتضان الأنبوب على الخلاط الأسطواني المائل عند 5 دورات في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند RT.
- اشطف السلك ثلاث مرات في 1x PBS وقم بتخزينه في الظلام في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 1x PBS حتى الفحص البصري.
ملاحظه: يجب دائما غمر الجزء الوظيفي من السلك لتجنب إلحاق الضرر بالخلايا.
- شحن السلك من معلقات الخلايا منخفضة الحجم (طريقة الشحن البديلة إلى: 2.1. شحن السلك باستخدام كمية كبيرة من معلقات الخلية)
- أعد تعليق الخلايا المسماة عند 1،000،000 خلية / مل في 1x PBS.
- قم بتثبيت ماصة باستور زجاجية يمكن التخلص منها مقاس 150 مم أفقيا على الرف.
- قم بإزالة السلك من حجرة التخزين ولكن احتفظ بالغطاء المطاطي الأصفر الذي يحمل السلك.
- ضع السلك في الماصة بحيث يكون الجزء الوظيفي موجودا في طرف ماصة باستور ولا يلامس الزجاج.
ملاحظه: يجب ألا يبرز طرف السلك من طرف ماصة باستور. تجنب توصيل الطرف الخلفي لطرف ماصة باستور بالغطاء المطاطي الذي يثبت السلك. إذا تم توصيلها بإحكام، فلا يمكن تحميل معلقات الخلية من الجانب الآخر إلى طرف الماصة.
- قم بتحميل 15 ميكرولتر من تعليق الخلية في طرف ماصة باستور التي تغطي الجزء الوظيفي من السلك.
- احتضن السلك لمدة 10 دقائق. قم بتدوير السلك المجمع/طرف ماصة باستور يدويا كل دقيقة.
- قم بإزالة السلك من طرف ماصة باستور ، واشطفه في 5 مل من 1x PBS وقم بتخزينه في الظلام عند 2-6 درجات مئوية في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 1x PBS حتى الفحص البصري.
ملاحظه: يجب دائما غمر الجزء الوظيفي في 1x PBS لتجنب الإضرار بالخلايا.
< p class = "jove_title" >
3.
عد الخلايا على السلك
ملاحظة: احتفظ دائما بالجزء الوظيفي من السلك مغمورا في 1x PBS لتجنب الإضرار بالخلايا.
- استخدم قلم شحوم لرسم منطقة مستطيل على شريحة زجاجية وأضف 500 ميكرولتر من 1x PBS.
- ثني الجزء غير الوظيفي من السلك وضعه على الشريحة الزجاجية بحيث يتم غمر الجزء الوظيفي في 1x PBS.
ملاحظه: تناسب مساحة المستطيل وحجم 1x PBS لتغطية الجزء الوظيفي من السلك بالكامل. استخدم شريطا لاصقا مزدوج الوجه لتركيب الجزء غير الوظيفي من السلك على الشريحة.
- افحص بصريا جانبي السلك لتعداد الخلايا الملتقطة (الشكل 1B و 1F).
ملاحظه: يتم تحديد وجود الخلايا باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات ل DAPI و FITC. يمكن فحص جانبي السلك وتقييم عدد الخلايا (لأعداد الخلايا العالية) أو عدها (ممكن فقط إذا تم توصيل أعداد منخفضة من الخلايا بالسلك). يمكن تخطي هذه الخطوة إذا لم يكن تعداد الخلايا ضروريا.
- بعد المسح ، ضع السلك مرة أخرى في أنبوب 15 مل يحتوي على 1x PBS ، وقم بتخزين السلك في الظلام.
ملاحظه: يمكن قطع معظم الجزء غير الوظيفي من السلك (بما في ذلك الانحناء) وإزالته مما يسهل التخزين.
< p class = "jove_title" >
4.
انفصال واستعادة الخلايا المستهدفة
ملاحظة: يجب أن يتم فصل الخلايا في غضون 4 ساعات بعد العزل.
- قم بإذابة 4 مجم من مكون المخزن المؤقت للتحرير (جدول المواد والكواشف) لكل مل من 1x PBS وقم بتصفية المحلول من خلال مرشح معقم 0.2 ميكرومتر للحصول على المخزن المؤقت الجاهز للاستخدام.
ملاحظه: يتكون بوليمر السلك من هيدروجيل يعمل بأجسام مضادة مضادة ل EpCAM مما يسمح بالارتباط بالخلايا المستهدفة التي تقدم EpCAM. يحتوي المخزن المؤقت للإطلاق على إنزيم محلل للبروتين من الكربون والأكسجين قادر على شق الهيدروجيل. يؤدي الانقسام المحلل للبروتين إلى تدهور البوليمر وبالتالي انفصال الخلايا التي تم التقاطها.
- قم بتسخين المخزن المؤقت للتحرير مسبقا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- أضف 1.6 مل من المخزن المؤقت للتحرير لملء أنبوب تفاعل سعة 1.5 مل.
ملاحظه: تسمح الأنابيب المصممة لأحجام تفاعل 1.5 مل بتطبيق 1.6 مل وهو أمر ضروري لغمر الجزء الوظيفي من السلك.
- احتضان الجزء الوظيفي من السلك في المخزن المؤقت للتحرير عند 37 درجة مئوية (حمام مائي) لمدة 20 دقيقة. استخدم الغطاء المطاطي المشحون مع السلك بدلا من غطاء الأنبوب لتثبيت السلك في أنبوب 1.5 مل لتجنب التلوث أثناء الحضانة في الحمام المائي.
- انقل مجموعة السلك / الأنبوب إلى شاكر عند RT و 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة
ملاحظه: يبلغ مدار شاكر 1.5 ملم.
- ضع مجموعة السلك / الأنبوب في جهاز طرد مركزي وقم بتدويرها عند 300 × جم لمدة 10 دقائق.
- قم بإزالة السلك من الأنبوب ، وأغلق الغطاء وقم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 10 دقائق < / >
ملاحظه: يمكن تخزين السلك في 1x PBS عند 2-6 درجة مئوية في الظلام لعد الخلايا لتقييم كفاءة الانفصال / التحقق من الخلايا المتبقية على السلك.
- لتقليل حجم تعليق الخلية ، قم بإزالة كل ما عدا 100 ميكرولتر (التلاعب الدقيق) أو بدلا من ذلك 300 ميكرولتر (الطرد المركزي الخلوي والتشريح الدقيق بالليزر اللاحق) من المادة الطافية وانتقل على الفور إلى أخذ العينات أحادية الخلية.
