أخذ عينات أحادية الخلية باستخدام المعالجة الدقيقة: تقنية لعزل الخلايا المفردة من تعليق الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Chen S. et al. التخصيب المسبق للخلية المستهدفة وتضخيم الجينوم الكامل لتوصيف خلية واحدة في اتجاه مجرى النهر. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو تقنية عزل الخلايا المفردة من مجموعة من الخلايا المستهدفة لإجراء تحليل المصب. في هذه الطريقة ، يتم استخدام معالج دقيق مثبت على المجهر لعزل عالي الدقة لخلية مستهدفة واحدة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. أخذ العينات أحادية الخلية

1. التلاعب الدقيق
   ملاحظة: للسماح بتطبيقات المصب مثل تحليل الجينوم الكامل (WGA) ، ستتم إضافة خلايا مفردة معزولة إلى 2 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتحلل الخلية. قم بإعداد مزيج رئيسي وفقا لعدد الخلايا المراد معالجتها. احسب الأحجام الإضافية للخسارة بسبب سحب العينات وضع المزيج الرئيسي لتحلل الخلايا على الجليد.
   1. تحضير المزيج الرئيسي لتحلل الخلايا (مكونات مجموعة WGA ، جدول المواد والكواشف). باختصار ، امزج 2.0 ميكرولتر من محلول التفاعل ، و 1.3 ميكرولتر من أوكتيل فينوكسي بولي إيثوكسي إيثانول (محلول 10٪) ، و 1.3 ميكرولتر من 4- (1،1،3،3-رباعي ميثيل بوتيل) فينيل بولي إيثيلين جلايكول (محلول 10٪) ، و 2.6 ميكرولتر من محلول البروتيناز K ، و 12.8 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase / DNase للحصول على مزيج رئيسي ل 10 عينات (الحجم الإجمالي 20 ميكرولتر).
      ملاحظه: لمزيد من العينات ، قم بزيادة الأحجام وفقا لذلك.      
   2. استخدم قلم شحوم لرسم منطقة تثبت تعليق الخلية في مكانه. اضبط المساحة والحجم إذا كانت كثافة الخلية عالية جدا (على سبيل المثال ، ضع علامة على مساحة أكبر على الشريحة الزجاجية ، وقم بتحميل 1x PBS وحصة من تعليق الخلية).
   3. ماصة تعليق الخلية المستهدفة بالكامل على الشريحة الزجاجية.
   4. انقل الشريحة الزجاجية إلى مجهر مزود بمعالج دقيق. دع الخلايا تستقر لمدة 5 دقائق.
   5. قم بإعداد 0.2 مل من أنابيب PCR محملة ب 2.0 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتحلل الخلايا (المحضر في الخطوة 1.1.1) وتخزينها على الثلج.
   6. اجمع الخلايا المفردة في 1 ميكرولتر من 1x PBS باستخدام المعالج الدقيق وانقل الخلايا إلى أنبوب يحتوي على مزيج تحلل الخلية الرئيسي.
      ملاحظه: لنقل الخلايا التي تم التلاعب بها إلى المخزن المؤقت لتحلل الخلية ، ضع الشعيرات الدموية مباشرة في 2 ميكرولتر من محلول التحلل وأخرجها حتى يمكن رؤية الفقاعات.
   7. قم بتدوير العينة لفترة وجيزة عند 2000 × جم لمدة 3 ثوان باستخدام جهاز ميكروفوج سطح المكتب لتجميع كل السائل في قاع الأنبوب. ضع العينات على الثلج.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) ثيرمو فيشر العلمي 10010-015 أنابيب الفراغ EDTA (أو Na-heparin) دينار بحريني 366450 (أو 366480) يستخدم كأنبوب تفاعل لالتقاط الخلايا المستهدفة خارج الجسم الحي ماصات باستور 150 مم فولاك D810 تستخدم للتطبيق المنخفض الحجم للخلايا على C & R قلم الشحوم داكو S2002 تستخدم على الشرائح الزجاجية لتثبيت تعليق الخلية في مكانه Axiovert M200 مجهزة ب Mikromanipulator MMJ و CellTram vario زايس / إيبندورف استخدم المعالجة الدقيقة في متناول اليد الشعيرات الدموية الدقيقة (قطرها 25 ميكرومتر) ، CustomTip من النوع الأول إيبندورف 930001201 تستخدم للتلاعب الدقيق بالخلايا 0.2 مل أنابيب PCR بوزيم 710920