أخذ عينات الخلية المفردة باستخدام التشريح الدقيق بالليزر: تقنية لحصاد الخلايا المستهدفة من مجموعة خلايا غير متجانسة

الملخص

المصدر: Chen S. et al. التخصيب المسبق للخلية المستهدفة وتضخيم الجينوم الكامل لتوصيف خلية واحدة في اتجاه مجرى النهر. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو تقنية الحصول على خلية واحدة من مجموعة خلايا غير متجانسة باستخدام التشريح الدقيق لالتقاط الليزر. يمكن استخدام الخلية المفردة المعزولة لمزيد من الدراسات الجينومية أو أبحاث السرطان.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. أخذ العينات أحادية الخلية

1. التشريح المجهري بالليزر
   ملاحظة: ستتم إضافة خلايا مفردة إلى 4.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي لتحلل الخلايا (مكونات مجموعة WGA وجدول المواد والكواشف) ل WGA.
   1. تحضير المزيج الرئيسي لتحلل الخلية وفقا ل Czyż et al. عن طريق خلط 5.0 ميكرولتر من محلول التفاعل ، 1.3 ميكرولتر من أوكتيل فينوكسي بولي إيثوكسي إيثانول (محلول 10٪) ، 1.3 ميكرولتر من 4- (1،1،3،3-tetramethylbutyl) فينيل بولي إيثيلين جلايكول (محلول 10٪) ، resp. ، 2.6 ميكرولتر من محلول البروتيناز K و 34.8 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase / DNase للحصول على مزيج رئيسي ل 10 عينات (الحجم الإجمالي 45 ميكرولتر). ضع المزيج الرئيسي على الثلج.
      ملاحظه: لمزيد من العينات ، قم بزيادة الأحجام وفقا لذلك.
   معالجة
   2. الأشعة فوق البنفسجية الشرائح المطلية بالغشاء المناسبة للتشريح الدقيق بالليزر. ضع الشرائح في جهاز ربط متشابك للحمض النووي وقم بتعريضها لأعلى الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقائق تقريبا.
   3. قم بتجميع الشريحة المطلية بالغشاء في جهاز طرد خلوي وقم بتدوير تعليق الخلية بالكامل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق < br / > ملاحظه: عند استخدام نظام في السائل ، حيث يتم الطرد المركزي للخلايا على الشريحة في المحلول ، قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي الخلوي وقم بتطبيق الدوران الجاف عند 1140 × جم لمدة 1 دقيقة.
   4. انتقل مباشرة إلى التشريح الدقيق بالليزر أو اترك الأجزاء الخلوية تجف في الهواء طوال الليل وتجميد العينات عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.
   5. ماصة 4.5 ميكرولتر من تحلل الخلايا تمزج في غطاء أنبوب PCR سعة 0.2 مل وتحصد خلايا مفردة عن طريق التشريح الدقيق بالليزر.
   6. استرجع أنبوب PCR من مجهر التشريح المجهري بالليزر وأغلق الأنبوب. اجمع كل السوائل في قاع الأنبوب عن طريق الدوران القصير وضع العينة على الثلج.
   7. تابع WGA أحادي الخلية أو قم بتخزين العينات المعزولة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد قبل المعالجة الإضافية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ملحق McCoy's 5A متوسط (1x) مع L-Glutamine ثيرمو فيشر العلمي 16600-082 وسط الاستزراع المستخدم لخلايا HT-29 ، وتكييف وسط الثقافة مع خط الخلية المستخدم في التجارب محلول عازلة HEPES (1 متر) جمعية المحاسبين الفلسطينيين س 11-001 مكمل غذائي لماكوي 5A متوسط مصل الأبقار الجنيني الذهبي جمعية المحاسبين الفلسطينيين أ 15-151 ملحق لوسط McCoy's 5a المعدل البنسلين الستربتومايسين (100x) الغرب الحيوي L0018-100 ملحق لوسط McCoy's 5a المعدل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) ثيرمو فيشر العلمي 10010-015 أكوتاز الغرب الحيوي L0950-100 محلول انفصال الخلية (زراعة الخلايا) حمام مائي جي إف إل النوع 1003 تستخدم لحلول التسخين المسبق حاضنه ثيرمو فيشر العلمي تستخدم لاحتضان الخلايا (ثقافة الخلايا) 50 مل أنابيب تفاعل VWR 525-0403 خلاط الأسطوانة ستيوارت العلمية SRT6D تستخدم لربط الخلايا بالسلك مع الحفاظ على الخلايا من الترسيب طقم تكاثر الخلايا CellTrace CFSE ثيرمو فيشر العلمي سي 34554 تستخدم لتسمية الخلايا الحية (التسمية السيتوبلازمية) هوشت: 33342 H3570 ثيرمو فيشر العلمي تستخدم لتلطيخ الحمض النووي (صبغة نواوية) جهاز طرد مركزي (مجهز لحمل أنابيب تفاعل 15 مل و 50 مل) ثيرمو فيشر العلمي هيريوس ميجافوجي 40R تستخدم لتكوير الخلايا المراقب Z1 (مجهر التشريح المجهري الفلوري / الليزر) كارل زايس التصوير المجهري مجهر مقلوب (مناعي) قادر على التشريح المجهري بالليزر. يجب أن تكون المجاهر الفلورية قادرة على اكتشاف Hoechst 33342 (مرشح DAPI) و CFSE (مرشح FITC) ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 4503-50 جرام تستخدم لطلاء الأسطح الزجاجية / البلاستيكية MS1 مينيشاكر سيجما ألدريتش Z404039 تستخدم للدوامة جهاز التفريغ CANCER03 DC03 جيلوبي جيل 003 سلك وظيفي قادر على عزل وفصل الخلايا الميثيثة الميثيثة الإيجابية (يشار إليها أيضا باسم الصيد والإفراج ، C & R) إبر الحقنة (G20) VWR 613-0554 تستخدم لثقب الأغطية المطاطية للسماح للجزء غير الوظيفي من C & R بالقيادة من خلاله غرفة نيوباور روث الطراز T729.1 تستخدم لحساب الخلايا ماصات باستور 150 مم فولاك D810 تستخدم للتطبيق المنخفض الحجم للخلايا على C & R قلم الشحوم داكو S2002 تستخدم على الشرائح الزجاجية لتثبيت تعليق الخلية في مكانه دلفيا بلاتشاكر بيركين إلمر 1296-003 تستخدم للتحريض أثناء انفصال الخلية أنابيب 1.5 مل إيبندورف 30,125,150 مجموعة Ampli1 WGA أنظمة السيليكون الحيوية يتم طلبها عبر Silicon Biosystems 0.2 مل أنابيب PCR بوزيم 710920 أجهزة الطرد المركزي الخلوي والمعدات هيتيتش عالمي 32 استخدم جهاز الطرد المركزي الخلوي في متناول اليد الدراجة الحرارية بيو راد ثنائي محرك الحمض النووي يمكن استخدام كل دراجة حرارية بغطاء ساخن أجهزة الطرد المركزي الدقيقة روث سي اكس73.1 استخدم جهاز الطرد المركزي المكتبي في متناول اليد الأشعة فوق البنفسجية ستراتالينكر 1800 ستراتاجين 400072 استخدم رابط الحمض النووي المتقاطع في متناول اليد