الحقن داخل البروستاتا للخلايا السرطانية: تقنية لتوصيل الخلايا السرطانية لإنشاء نموذج فأر سرطان البروستاتا التقويمي

الملخص

المصدر: Anker، J. F. et al. نموذج الفئران المتزابقي ذو الإضاءة الحيوية والفلورية لسرطان البروستاتا المعتمد على الأندروجين والمقاوم للإخصاء. J. Vis. إكسب. (2018)

في هذا الفيديو ، نوضح إجراء إعطاء الحقن داخل البروستاتا لخلايا سرطان البروستاتا في نموذج الفأر. يمكن استخدام نماذج الفئران التقويمية لدراسة أصل المرض والاستجابة للعلاجات العلاجية في بيئة غير جراحية وذات صلة سريريا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الماوس قبل الجراحة

ملاحظة: الفئران المنزلية في منشأة الجامعية لمدة أسبوع واحد على الأقل قبل الجراحة للسماح بالتكيف الكافي وتقليل إجهاد. يتم تنفيذ الخطوات 1.1-1.6 بواسطة مساعد الجراح. يتم تنفيذ جميع الخطوات الجراحية اللاحقة من قبل الجراح باستخدام قفازات معقمة وأدوات جراحية بتقنية معقمة.

1. تخدير الفئران بالأيزوفلوران (2-5٪ للحث عبر الغرفة ، 1-3٪ للصيانة عبر مخروط الأنف). تحقق من الحث الكامل من خلال فقدان منعكس قرصة إصبع القدم.
2. قم بوزن الفئران وإعطاء ما لا يقل عن 0.05 مجم / كجم من مسكن البوبرينورفين s.c.
   ملاحظه: وزن الفأر ≥20 جم مثالي لحقن البروستاتا الناجحة.
3. ضع ترطيب مرهم العين على كلتا العينين لمنع جفاف القرنية.
4. احلق كل الفراء من البطن.
5. تعقيم البطن بثلاث جولات من التطبيق الدائري للمقشر الجراحي باستخدام ضمادات معقمة غير ملتصقة متبوعة بمناديل كحولية معقمة. دع البطن يجف.
   ملاحظه: بالنسبة لبقية العملية الجراحية ، يجب استخدام القفازات المعقمة والأدوات الجراحية فقط للاتصال ببطن الفأر المعقم.
6. انقل الفأر ضعيفا على سطح نظيف على وسادة تدفئة مباشرة تحت هدف المجهر الجراحي النظيف.
7. قم بتغطية الماوس بستارة معقمة مع ثقب صغير مقطوع فوق البطن.

فئة

2. الحقن داخل البروستاتا

ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات الجراحية في ظل ظروف معقمة. يجب أن يتم ضبط المجهر أو وضع الماوس أو أي شيء آخر غير معقم بمساعدة إضافية.

1. قم بإجراء شق بطول 1 سم تقريبا من الجلد الخارجي على طول خط الوسط للبطن متفوق على القضيب والغدد الجرثوية (الشكل 1 د).
2. افصل النسيج الضام بين جلد البطن الخارجي وعضلات البطن الداخلية عن طريق فتح المقص بين الطبقات.
3. قم بإجراء شق مماثل في عضلات البطن الداخلية ، باستخدام ملقط لرفع العضلات لتجنب ثقب الأمعاء أو المثانة (الشكل 1 د).
4. حدد موقع إحدى الحويصلات المنوية الثنائية (الشكل 1 أ ، أبيض) / فصوص البروستاتا الأمامية (الشكل 1 أ ، أسود) ، والتي غالبا ما تكون خلفية وجانبية ومتفوقة قليلا على المثانة (الشكل 1 أ ، أصفر) ، ولكن هذا قد يختلف بين الفئران. فصوص البروستاتا الأمامية شفافة ومتصلة بالانحناء الأصغر للحويصلات المنوية البيضاء.
5. ارفع طرف الحويصلة المنوية برفق باستخدام ملقط أنسجة Graefe لخلق توتر على الأنسجة دون ثقب الحويصلة المنوية (الشكل 1 ه).
6. امزج محلول Myc-CaP matrigel عن طريق ماصة الجنتيل (التي يقوم بها مساعد الجراح) ، حيث قد تكون الخلايا قد تحببت ، وتستنشق ببطء 30 ميكرولتر (1 × 10⁶ خلايا) في الإبرة لتجنب فقاعات الهواء.
7. أدخل بعناية شطبة الإبرة بالتوازي مع المحور الطويل لفص البروستاتا الأمامي. قم بحقن 30 ميكرولتر ببطء في الفص ثم اسحب الإبرة ببطء لمنع التسرب (الشكل 1F). تحقق من الحقن الكافي عن طريق احتقان فص البروستاتا الأمامي (الشكل 1G).
8. أمسك الحويصلة المنوية وفص البروستاتا بعناية خارج الفأر لمدة 30 ثانية تقريبا للسماح للماتريجيل بالتصلب جزئيا داخل الفص. خلال هذا الوقت ، اجمع أي تسرب للمحلول الخلوي في البطن باستخدام قضيب معقم برأس بوليستر لمنع تطور الورم غير التقويمي دون الضغط على فص البروستاتا المحقون.
9. أعد الحويصلة المنوية وفص البروستاتا المحقون بعناية إلى البطن دون الضغط على الفص. استبدل أي أنسجة خارجية.
10. قم بإجراء خيوط جراحية مستمرة لإغلاق عضلات البطن الداخلية باستخدام خيوط إبرة القطع العكسية القابلة للامتصاص 5-0 فيكريل.
11. قم بإجراء خيوط متقطعة لإغلاق جلد البطن الخارجي باستخدام خيوط إبرة قطع عكسية غير قابلة للامتصاص 4-0 من النايلون. ملاحظه: يمكن أيضا استخدام دبابيس معقمة مقاس 9 مم لإغلاق جلد البطن الخارجي. ومع ذلك ، على عكس الغرز ، فإنها تتداخل مع أي إشارة تصوير لاحقة للورم الفلوري والفلورسنت.
12. نظف جميع الأدوات بمناديل إيثانول معقمة (يفتحها مساعد الجراح) وضعها في معقم زجاجي لمدة 30 ثانية. اترك الأدوات تجف قبل استخدامها على الماوس التالي.
13. اغسل المحقنة والإبرة في محلول ملحي معقم (يفتحه مساعد الجراح) لمنع الانسداد بواسطة بقايا matrigel.
    ملاحظه: يجب أن يكون مساعد الجراح حاضرا لجميع العمليات ، وإجراء جميع الاستعدادات غير المعقمة للفأر قبل الجراحة ورعاية الفئران بعد الجراحة ، بالإضافة إلى خلط محلول Myc-CaP matrigel قبل الحقن. لتقليل الوقت ، نظرا لأن كل إجراء للفأر داخل البروستاتا سيتطلب 20-30 دقيقة ، يمكن لمساعد الجراح البدء في إعداد الفأر التالي بينما يقوم الجراح بخياطة الماوس الحالي.

< p class = "jove_title" >3. رعاية الفئران بعد الجراحة

1. يجب إعطاء 1 ملغ/كغ من مسكن ميلوكسيكام على الفور و24 ساعة و48 ساعة بعد الجراحة.
2. اسمح للفئران بالتعافي في قفص بدون فراش في منتصف الطريق على وسادة تدفئة. راقب الفئران لمدة 30 دقيقة على الأقل بعد الجراحة حتى تستعيد الحركة والنشاط الطبيعي ، وبعد ذلك ضعها في قفص نظيف مع الطعام على أرضية القفص.
3. راقب الفئران يوميا التئام الجروح بشكل صحيح ووزن الجسم والاستمالة والتجول بعد الجراحة. افصل الفئران إلى أقفاص فردية بناء على أي دليل على القتال.
4. قم بإزالة أي خيوط متبقية في غضون 14 يوما بعد الجراحة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: فص البروستاتا الأمامي ، وتصريف الغدد الليمفاوية ، وتقنية تمثيلية لحقن خلايا البروستاتا داخل البروستاتا. صور لفص البروستاتا الأمامي الأيمن (أ) (أسود ، *) ، الحويصلة المنوية اليمنى المرفقة (أبيض) ، الخصية اليمنى ووسادة الدهون (خضراء) ، والمثانة (صفراء) ، (ب) الغدد الليمفاوية شبه الأبهرية الثنائية لتصريف البروستاتا (برتقالي) ، (ج) مق...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خط خلايا Myc-CaP ATCC رقم التعريف الهاتفي - 3255 تحقق من خلو الميكوبلازما قبل الاستخدام مقص التشريح الدقيق روبوز RS-5910 ملقط Graege روبوز RS-5135 ملقط أنسجة Graefe روبوز RS-5150 حامل إبرة أولسن هيغار مع
قواطع خياطة FST 12002-12 حقنة 50 ميكرولتر 705 RN SYR هاملتون 7637-01 تعقيم بغاز أكسيد الإيثيلين 28 قياس الإبر محور صغير RN H هاملتون 7803-02 نمط النقطة 4 ، الزاوية 45 درجة ، الطول 0.75 بوصة. معقم بغاز أكسيد الإيثيلين RPMI جيبكو 18875-093 FBS جيبكو هاتف: 10437-028 بينسلين / ستربتومايسين جيبكو 15140-122 برنامج تلفزيوني جيبكو 14190-144 غشاء القاعدي Matrigel
مصفوفة ، خالية من الفينول الأحمر ، خالية من LDEV كورنينج 356237 قم بإذابة الثلج في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها < br / > قبل الاستخدام إيزوفلوران هنري شاين هاتف: 11695-0500-2 تم الحصول عليها من مركز جامعة نورث وسترن للطب المقارن (CCM) بوبرينورفين هيروكلوريد 0.3
ملغ / مل هاتف: 12496-0757-5 مادة خاضعة للرقابة ، مكتسبة
من جامعة نورث وسترن CCM 26 حقنة قياس 5/8 دينار بحريني 309597 لحقن ميلوكسيكام والبوبرينورفين تزييت مرهم العين اكرون 17478-162-35 مقشر البيتادين الجراحي (بوفيدونيودين ، 7.5٪) منتجات بوردو 67618-151-16 ضمادات معقمة غير ملتصقة مور الطبية هاتف: 10775 مناديل كحولية معقمة فيشر ساينتيك 22-363-750 المجهر الجراحي Stemi DV4 زييس أدوات تطبيق معقمة من البوليستر البروتستانتي 25-806 1PD 5-0 فيكريل قابلة للامتصاص خيوط إبرة القطع العكسي الغرز الإلكترونية J493G 4-0 خيوط إبرة قطع عكسية غير قابلة للامتصاص الغرز الإلكترونية 699 ساعة معقم الخرز الزجاجي أدوات العلوم الدقيقة 18000-45 محلول ملحي معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم هوسبيرا 0409-4888-02