توليد خلايا سرطان البروستاتا المقاومة للكيماويات: إجراء للحصول على خلايا سرطانية مقاومة للأدوية في المختبر

الملخص

المصدر: Mohr, L. et al. جيل من نماذج خلايا سرطان البروستاتا لمقاومة العامل المضاد للانقسام الدوسيتاكسل. J. Vis. Exp. (2017)

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لتوليد نماذج الخلايا المقاومة للتاكسان لسرطان البروستاتا. يمكن أن تساعد هذه النماذج في دراسة المسارات التي ينطوي عليها التقدم إلى مقاومة الدوسيتاكسيل لدى مرضى سرطان البروستاتا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد خلايا سرطان البروستاتا المقاومة للدوسيتاكسيل

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قم بإجراء العلاجات الخلوية باستخدام مخزون محلول Docetaxel المستخدم لتحديد تركيز الدواء IC50 (قم بإعداد مخزون كاف مسبقا للاستخدام التجريبي). يجب زراعة الخلايا الأبوية بالتوازي في قارورة صغيرة طوال العملية بأكملها وتعريضها للمركبة (DMSO) بأحجام مقابلة تحاكي الكميات المستخدمة في قوارير الدوسيتاكسيل المعالجة.

1. لوحة DU145 أو 22Rv1 خلايا في 150 سم² قارورة تحتوي على 20 مل من الوسائط (3.5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة ل DU145 و 6.5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة ل 22Rv1). يوصى باستخدام 10 إلى 20 قارورة من الخلايا للحصول على خلايا كافية في نهاية البروتوكول.
2. بعد 24 ساعة ، عندما تكون الخلايا عند التقاء حوالي 70-80٪ (الشكل 1 ب ، قبل دوسيتاكسل) ، أضف دوسيتاكسيل بتركيز IC50 (5 نانومتر للخلايا الموضحة في هذا البروتوكول).
3. بعد 72 ساعة ، قم بشفط الوسائط المحتوية على المخدرات وأضف وسائط جديدة خالية من الدوسيتاكسيل (الشكل 1 ب ، 72 ساعة بعد Docetaxel). قم بتغيير الوسائط كل 3-4 أيام. في غضون 1-2 أسابيع تقريبا ، ستظهر المستنسخة المقاومة واضحة تحت المجهر (الشكل 1 ب ، 7 و 14 يوما بعد الدوسيتاكسيل).
4. قم بشفط الوسائط ، واغسل الخلايا بعناية باستخدام 15 مل PBS واحتضانها ب 4 مل 0.05٪ Trypsin-EDTA لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا عن سطح القارورة.
5. أعد تعليق الخلايا المصابة بالتربسين من القارورة باستخدام 8 مل من الوسائط الطازجة. خلايا تجمع من جميع القوارير المعالجة. خلايا الحبيبات بالطرد المركزي (300 × جم ، 3 دقائق ، RT).
6. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 20 مل من الوسائط الطازجة وقم بلوحة الخلايا في 150 سم² قوارير (3.5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة ل DU145 و 6.5 × 10⁶ خلايا لكل قارورة ل 22Rv1).
7. بعد 24 ساعة ، عندما تكون الخلايا عند التقاء حوالي 70-80٪ ، أضف 5 نانومتر دوسيتاكسيل (تركيز IC50 الأولي) مرة أخرى.
8. كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.6 في اليوم 3.
9. بعد 24 ساعة ، عندما تكون الخلايا عند التقاء حوالي 70-80٪ ، عالجها بتركيز 2X IC50 Docetaxel (10 نانومتر للخلايا الموضحة في هذا البروتوكول).
10. كرر الخطوات من 1.3 إلى 1.8 ، بعد تصاعد جرعة تركيزات الدوسيتاكسيل (25 نانومتر ، 50 نانومتر ، 100 نانومتر ، و 250 نانومتر) ، لتوليد مجموعة مستقرة من الخلايا تنمو في القوارير تحت أعلى تركيز نهائي. بالنسبة للتركيزات الأعلى ، يمكن تنفيذ بروتوكول تصعيد الجرعة لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى يتم الوصول إلى تركيز 1,000 نانومتر (الشكل 2 أ).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: توليد أنظمة نموذج خلايا سرطان البروستاتا المقاومة لدوسيتاكسل.(أ) رسم تخطيطي يصور تحديد Docetaxel IC50 في خطوط خلايا سرطان البروستاتا الأبوية DU145 و 22Rv1 (الخطوة 1 من البروتوكول). يتم تضمين النسب المئوية المتوقعة لصلاحية الخلية والتركيزات المطلوبة لجرعة الدوسيتاكسيل. يتم تضمين الرسوم البيانية لقابلية صلاحية الخلية DU145 و 22Rv1 التي تشير إلى 5 نانومتر مثل IC50 بع...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خلايا DU145 ATCC إتش تي بي-81 22خلايا Rv1 ATCC رقم التعريف الهاتفي-2505 دوسيتاكسيل سيليك للكيماويات S1148 في DMSO (10 مللي متر) قارورة زراعة الأنسجة 150 سم ^ {2} صقر 355001 RPMI 1640 متوسط جيبكو 11875093 مكمل بنسبة 10٪ FBS و
1٪ بنيسيلين / ستربتومايسين كريم الأساس B مصل الأبقار الجنينية الجوزاء 900208 1X محلول ملحي مخزن بالفوسفات
(برنامج تلفزيوني) كورنينج 21-040 سم 0.05٪ تريبسين EDTA جيبكو هاتف: 25300-062 البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15140122