تحريض الالتهام الذاتي القائم على ADI في خلايا سرطان البروستاتا: تقنية قائمة على الإنزيم لقياس استجابة البلعم الذاتي في الخلايا

الملخص

المصدر: Changou، C. A. et al. التحليل الكمي للالتهام الذاتي باستخدام الفحص المجهري الفلوري ثلاثي الأبعاد المتقدم. J. Vis. Exp. (2013)

< p class = "jove_content">في هذا الفيديو ، نوضح تحريض الالتهام الذاتي القائم على الأرجينين ديميناز في خلايا سرطان البروستاتا. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري المتقدم لتصور التغييرات المرتبطة بتحريض الالتهام الذاتي ، بما في ذلك تكوين وتوزيع البلعمة الذاتية والجسيمات الحالة واندماجها في الجسيمات الذاتية.

البروتوكول

1. تحضير الخلايا للتصوير الحي

1. تنمو خلايا CWR22Rv1 التي تعبر عن السلسلة الخفيفة المقترنة بالبروتين الفلوري الأخضر 3 (LC3-GFP) في وسائط زراعة RPMI التي تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية على أطباق ثقافة زجاجية مطلية ب بولي D-lysine مقاس 35 مم. يجب طلاء الخلايا بكثافة كافية لتسهيل التكاثر السريع ، ولكن ليس لدرجة أن الخلايا تتضخم وتتجمع بحلول وقت التصوير.
2. عالج عينات الخلايا المختارة ب ADI (0.3 ميكروغرام / مل) في PBS.
3. قبل حوالي ساعة واحدة من التصوير ، قم بتخفيف 1.5 ميكرولتر من LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen ، CA) مع 20 مل RPMI يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية. استخدم الحلول التي تحتوي على ADI للعينات المحددة. قم بتسخين جميع الوسائط إلى 37 درجة مئوية قبل إضافتها إلى طبق الاستزراع.
4. احتضان الخلايا باستخدام RPMI الذي يحتوي على LysoTracker Red DND-99 لمدة 15-45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
5. قبل التصوير بحوالي 30 دقيقة ، قم بتشغيل العلبة البيئية WeatherStation واتركها متوازنة إلى 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ (بالهواء الرطب).
6. اغسل الخلايا ب PBS واستبدل الوسائط ب RPMI القياسي الذي يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية فقط. أضف ADI إلى العينات كما هو موضح.
7. قم بتركيب أطباق الاستزراع ذات القاع الزجاجي مقاس 35 مم في محول مخصص (Applied Precision, Inc., WA) ، ووضعها على مرحلة المجهر. استخدم زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520) على العدسة الموضوعية 60X 1.42 NA وضع طبق الثقافة المركب على المسرح.

< ص الفئة = "jove_title" > 2. الفحص المجهري فائق الدقة والإضاءة الهيكلية (OMX)

ملاحظة: ينطبق البروتوكول الموجود في هذا القسم على استخدام مجهر الإضاءة الهيكلية OMX (الدقة التطبيقية ، WA).

1. قم بتشغيل الطاقة الرئيسية والليزر المطلوب (410 نانومتر و / أو 488 نانومتر و / أو 532 نانومتر). انتظر لمدة 20 دقيقة حتى يتم تثبيت الليزر حراريا.
2. أضف زيت الغمر (معامل الانكسار 1.516 للعينات الثابتة في RT) على العدسة الموضوعية 60X 1.42 NA. إذا شوهدت فقاعات في قطرة الزيت ، فقم بتنظيف الهدف وإضافة الزيت مرة أخرى.
3. ضع شريحة العينة على المسرح وإذا لزم الأمر ، اترك 10 دقائق حتى تستقر الخلايا على الغطاء.
4. تهيئة برنامج الاستحواذ. استخدم الإضاءة الفلورية لضبط التركيز البؤري حتى يمكن رؤية مخطط حاد للخلية.
   ملاحظه: يجب توخي الحذر في جميع الأوقات لتقليل تعرض الخلايا للإثارة الفلورية ، حتى الحصول على الصورة الفعلية.
5. يمكن الحصول على فحص فسيفساء حلزوني لمعاينة مساحات أكبر من العينة لتحديد الخلايا أو مناطق الاهتمام. يوصى باستخدام أوقات تعريض قصيرة (1-10 مللي ثانية) وقوة إثارة منخفضة (إرسال 0.1-1٪) أثناء مسح العينة أو العثور على الأهداف.
6. تحديد الجسيمات الذاتية عن طريق مضان GFP-LC3. تحديد الجسيمات الحالة بواسطة Alexa Fluor 555 anti-LAMP (بروتين الغشاء المرتبط باللايزوسوم) ونواة الخلية باستخدام DAPI (عينات ثابتة).
7. اختر الظروف التجريبية بما في ذلك الطول الموجي للإثارة ومساحة الصورة (على سبيل المثال ، 512 × 512) ، وسمك المكدس ، ووقت التعرض ، ونسبة نقل الليزر. بالنسبة للصور فائقة الوضوح، تأكد من تمكين خيار الإضاءة المنظمة. للفحص المجهري لإزالة الالتواء على OMX ، حدد خيار الإضاءة التقليدية.
8. للحصول على أفضل نتائج إعادة البناء ، حدد الظروف التجريبية بحيث يتراوح الحد الأقصى لعدد الكثافة بين 10,000 و 15,000 أثناء الاستحواذ. إذا كان التبييض الضوئي مصدر قلق ، فيمكن استخدام التصوير عند التعرض المنخفض (العدد بين 5,000 و 10,000). من الناحية المثالية ، يجب ألا ينخفض العدد بأكثر من عاملين خلال عملية الاستحواذ بأكملها ، ويجب تجنب الانخفاض بأكثر من معامل أربعة. إذا لزم الأمر ، قم بتقليل سمك المكدس لضمان عدد الكثافة المستدام. تشبع الكاميرا عند 64,000 عدد ، لذلك يجب ألا تتجاوز الكثافة القصوى هذا أبدا. بالنسبة للعينات الجيدة ، وجدنا أن الظروف التجريبية هي 10 ~ 50 مللي ثانية من وقت التعرض مع نقل ليزر بنسبة 1٪. يفضل العينات الساطعة والقابلة للصور التي يمكن تصويرها بشكل متكرر. مطلوب بقعة ثابتة للصور ذات الفاصل الزمني وفائقة الحل.
9. لتقليل الضوضاء، يوصى باستخدام سرعة قراءة 95 ميجاهرتز (خيار السرعة المتوسطة) ووقت الاستحواذ البالغ 2 مللي ثانية أو أكثر. يتم الحصول على القطع الأثرية المتزايدة في الصورة المعاد بناؤها عندما تتحرك العينة أثناء الاستحواذ. بسبب هذا التأثير ، يوصى بالتعريض القصير للخلايا غير الملتصقة أو سريعة الحركة.
10. يمكن إجراء التصوير متعدد القنوات في وقت واحد أو بالتتابع. ينتج عن الوضع المتسلسل تداخل أقل وبالتالي يوصى به.
11. لتقليل التبييض الضوئي ، يوصى عموما بالتصوير بأطوال موجات أطول للإثارة أولا (532 نانومتر ، 488 نانومتر ، ثم 410 نانومتر). ومع ذلك ، بالنسبة للنتائج التجريبية الموضحة في الشكل 1 ، تم عكس هذا الترتيب (أي 48 نانومتر و 532 نانومتر و 410 نانومتر) بسبب الثبات الضوئي لهذه العينة المعينة.
12. قم بتعيين الحد العلوي/السفلي لمكدس Z عن طريق تحريك مرحلة المجهر حتى يصبح الجزء العلوي/السفلي من الخلايا خارج نطاق التركيز قليلا. يجب أن تظل المسافة المطلوبة بين كل صورة ثابتة عند 0.125 ميكرومتر للتصوير فائق الدقة ، حيث يأخذ برنامج إعادة الإعمار هذه القيمة كافتراضي.
13. أعد بناء مكدسات الصور باستخدام SoftWorX (الدقة التطبيقية ، WA) وتحليلها باستخدام VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer ، MA).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. توزيع البلعمة الذاتية والليزوزوم في الخلية.أ. أعلى) مقارنة جنبا إلى جنب للصور المكتسبة والمعاد بناؤها في وضع DV (محاكاة تفكيك المجال الواسع ، يسار) ووضع الإضاءة الهيكلية باستخدام مجهر OMX (يمين). يمثل شريط المقياس 5 ميكرومتر. ب. أسفل) تحديد الموقع المشترك على نطاق صغير للبلعمة الذاتية والجسيمات الحالة (يشار إليه بالأسهم).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أرجينين ديميناز (ADI) DesigneRx هيبس سيغما إتش 4034 الكازين سيغما سي 5890 بارافورمالدهيد صياد 4042 سابونين سيغما إس 4521 أليكسا مضاد للماوس 555 إنفيتروجين أ 21422 أليكسا مضاد للأرانب 647 إنفيتروجين أ21244 LysoTracker أحمر DND-99 إنفيتروجين L7528 مضاد للمصباح1 دي إس إتش بي H4A3 مضاد كاديرين إشارات الخلية #3195 SlowFade الذهب إنفيتروجين S36936 35 مم بولي دي ليسين لوحة سفلية زجاجية مطلية ماتيك P35GC-1.5-1.4-C رقم 1 ، غطاء 22 مم كورنينج # 2865-22 شرائح المجهر الكرة الأرضية العلمية 1324 جرام