استخراج البروتين وتحلل البروتين: طريقة للحصول على البروتينات من عينات أنسجة ورم البروستاتا وهضمها الأنزيمي إلى الببتيدات

الملخص

المصدر: Cheng ، L. C. et al. تخصيب الفوسفوببتيد إلى جانب قياس الطيف الكتلي الكمي الخالي من الملصقات للتحقيق في الفوسفوبروتيوم في سرطان البروستاتا. J. Vis. Exp. (2018)

< p class = "jove_content">يصف هذا الفيديو تقنية استخراج البروتين وهضمه للحصول على الببتيدات من أنسجة ورم البروستاتا. يمكن أن تساعد هذه الببتيدات في مزيد من التحليل في تحديد أهداف جديدة للعلاج بالأورام.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. استخراج البروتين

1. تحضير المخزن المؤقت للتحلل (الجدول 1). (يعتمد الحجم على عدد العينات المراد حصادها.)
2. حصاد الأنسجة
   1. قم بوزن الورم وأضف 2 مل من محلول التحلل المثلج لكل 100 مجم من الأنسجة في أنبوب اختبار الاستزراع. (عادة ما تكون هناك حاجة إلى 50 إلى 150 مجم من الوزن الرطب للأنسجة.)
3. قم بتجانس المحللة باستخدام الخالط اليدوي أو المنضدة (نبض 2x لمدة 15 ثانية). قم بتنظيف الخالط قبل العينة الأولى وبين العينات باستخدام 10٪ مبيض و 70٪ إيثانول وماء منزوع الأيونات على التوالي.
4. لتقليل الألكلة والألكلة ، قم بتسخين العينات المتجانسة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ثم قم بتبريدها على الثلج لمدة 15 دقيقة. على الجليد ، صوتنة المحللة 3x (أي نبض لمدة 30 ثانية مع توقف 60 ثانية بين النبضات). يجب ألا تكون العينة لزجة أو متكتلة في هذه المرحلة. سخني المحللة على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
5. الطرد المركزي المحللة في نفس أنبوب الصوتنة باستخدام دوار دلو التأرجح عند 3,500 × جم عند 15 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
6. حدد تركيز البروتين عن طريق إجراء اختبار برادفورد. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف المحللة إلى 5 مجم / مل باستخدام محلول تحلل. قم بتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية
   ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. قم بتجميد العينات عند -80 درجة مئوية واستخدمها لمزيد من التحليل.

< p class = "jove_title" >2. Lysate Digest

1. خفف العينة 12 ضعفا باستخدام 100 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني = 8.5) لتقليل كمية الجوانيدينيوم. خفف جميع العينات إلى نفس الحجم لتقليل آثار الهضم غير المتكافئ. وفر 12.5 ميكروغرام من المحلل غير المهضوم لتأكيده على هلام ملطخ بالكوماسي.
2. للحصول على 5 ملغ من البروتين ، أضف 10 ميكروغرام من Lysyl Endopeptidase (Lys-C) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-6 ساعات. اضبط الرقم الهيدروجيني على 8.0 عن طريق إضافة 1 M Tris غير معاير (الرقم الهيدروجيني ~ 11).
3. تحضير 1 مجم / مل من التربسين المعالج ب L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone (TPCK) في 1 ملي مولار حمض الهيدروكلوريك (مع 20 ملي كلوريد_{المكالسيوم 2}). أضف التربسين بنسبة 1: 100 تريبسين: بروتين واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
4. أضف نفس الكمية من التربسين الطازج كما في الخطوة 2.3. احتضنه عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
5. احتفظ ب 12.5 ميكروغرام من المحللة المهضومة لتأكيد الهضم الكامل على هلام ملطخ بالكوماسي.

< p class = "jove_title" >3. استخراج المرحلة العكسية

1. سجل حجم المحللة. قم بتصفية العينة باستخدام مرشح قطع 15 مل 10 كيلو دالتون. قم بالطرد المركزي للعينة عند 3,500 × جم باستخدام دوار دلو التأرجح (أو 3,500 × جم في دوار بزاوية ثابتة) عند 15 درجة مئوية حتى يصبح حجم الاحتباس أقل من 250 ميكرولتر (يستغرق ذلك حوالي 45-60 دقيقة). اجمع التدفق وتخلص من الاحتفاظ.

الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول.يوضح هذا الجدول تركيبات المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

مخزن مؤقت حجم تكوين 6 م عازلة تحلل كلوريد الجوانيدينيوم 50 مل 6 م كلوريد جوانيدينيوم ، 100 ملي مولار تريس 8.5 درجة حموضة ، 10 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين ، 40 ملي كلوروأسيتاميد ، 2 ملي أورثوفانادات الصوديوم ، 2.5 ملي بيروفوسفات الصوديوم ، 1 ملي مولار β-جليسيروفات ، 500 مجم ن-أوكتيل جليكوسيد ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 100 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم 50 مل 2.23 جم بيروفوسفات الصوديوم ديكاهيدرات ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 1 م β جليسيروفوسفات 50 مل 15.31 جم β جليسيروفوسفات ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 20 مل أضف 1 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 100٪ إلى 19 مل من الماء فائق النقاء 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 250 مل أضف 5 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 5٪ إلى 245 مل من الماء فائق النقاء المخزن المؤقت للشطف pY 250 مل 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 40٪ أسيتونيتريل ، ماء فائق النقاء إلى الحجم المخزن المؤقت للشطف pST 250 مل 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 50٪ أسيتونيتريل ، ماء فائق النقاء إلى الحجم المخزن المؤقت لربط IP 200 مل 50 ملي مولار ثلاثية درجة الحموضة 7.4 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 25 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم ، درجة الحموضة 7.5 10 مل قم بإذابة 19.7 مجم في 10 مل من الماء المعقم فائق النقاء ، ودرجة الحموضة إلى 7.5 مع 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (~ 10-15 ميكرولتر / 10 مل محلول) ، واجعله طازجا 1M عازلة فوسفات ، درجة الحموضة 7 1,000 مل 423 مل 1 م فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم ، 577 مل 1 م فوسفات هيدروجين الصوديوم المخزن المؤقت للتوازن 14 مل 6.3 مل أسيتونيتريل ، 280 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 1740 ميكرولتر حمض اللاكتيك ، 5.68 مل ماء فائق النقاء عازلة الشطف 20 مل 9 مل أسيتونيتريل ، 400 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 10.6 مل ماء فائق النقاء حل قياس الطيف الكتلي 10 مل 500 ميكرولتر أسيتونيتريل ، 200 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 9.3 مل ماء فائق النقاء المخزن المؤقت أ 250 مل 5 ملي مولار فوسفات أحادي البوتاسيوم (درجة الحموضة 2.65) ، 30٪ أسيتونيتريل ، 5 ملي كلوريد البوتاسيوم ، ماء فائق النقاء للحجم العازلة ب 250 مل 5 ملي مولار فوسفات أحادي البوتاسيوم (درجة الحموضة 2.65) ، 30٪ أسيتونيتريل ، 350 ملي كلوريد البوتاسيوم ، ماء فائق النقاء حسب الحجم 0.9٪ هيدروكسيد الأمونيوم 10 مل 300 ميكرولتر 29.42٪ هيدروكسيد الأمونيوم ، 9.7 مل ماء فائق النقاء

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية باناسونيك ام دي اف-U76V الفريزر -20 درجة مئوية VWR SCPMF-2020 دلو الدوار المتأرجح ثيرموفيشر العلمي 75004377 دوار نهاية طرف ثيرموفيشر العلمي 415110س س أنابيب Eppendorf منخفضة البروتين إيبندورف 22431081 التربسين ، TPCK المعالج ورثينجتون للكيماويات الحيوية LS003740 ليزيل إندوبيبتيداز واكو للصناعات الكيماوية النقية المحدودة هاتف: 125-05061 ماء MilliQ المياه منزوعة الأيونات المستخدمة لتحضير جميع المحاليل والمخازن المؤقتة سونيك ديمبراتور فيشر ساينتيك FB-120 سونيكاتور نظام البوليترون PT Kinematica AG بي تي 10-35 جي تي الخالط