تنقية الببتيد: تقنية قائمة على RP-HPLC لاستخراج الببتيدات من محللات البروتين المهضومة

الملخص

المصدر: Cheng ، L. C. et al. تخصيب الفوسفوببتيد إلى جانب قياس الطيف الكتلي الكمي الخالي من الملصقات للتحقيق في الفوسفوبروتيوم في سرطان البروستاتا. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نوضح الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات المرحلة العكسية لتنقية الببتيدات من خليط محللات البروتين المهضوم. ثم يتم تجميد هذه الببتيدات النقية وتخزينها للتطبيقات النهائية. يمكن أن يساعد تحليل الببتيدات في فهم الآليات التي تنطوي عليها الإشارات الخلوية والسرطان.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. استخراج المرحلة العكسية

1. ابدأ بمحللة بروتين مهضومة مسبقا في قارورة زجاجية. قم بتصفية العينة باستخدام مرشح قطع 15 مل 10 كيلو دالتون. قم بالطرد المركزي للعينة عند 3,500 × جم باستخدام دوار دلو التأرجح (أو 3,500 × جم في دوار بزاوية ثابتة) عند 15 درجة مئوية حتى يصبح حجم الاحتباس أقل من 250 ميكرولتر (يستغرق ذلك حوالي 45 - 60 دقيقة). اجمع التدفق وتخلص من الاحتفاظ.
   NOTE: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. قم بتجميد العينات عند -80 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
2. لتحمض العينة ، أضف ما يقرب من 20 ميكرولتر من 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) لكل مل من المحلل. امزجها جيدا وقم بقياس درجة الحموضة في العينة باستخدام شرائط الأس الهيدروجيني. اضبط الرقم الهيدروجيني على 2.5 باستخدام 5٪ TFA.
3. قم بتوصيل الطرف الأقصر لعمود C-18 بمشعب فراغ. اضبط المكنسة الكهربائية بين 17 و 34 كيلو باسكال (أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة). باستخدام الماصات الزجاجية، بلل العمود ب 3 مل من الأسيتونيتريل 100٪ (ACN). لا تدع العمود يجف.
4. باستخدام الماصات الزجاجية، قم بموازنة العمود بسعة 6 مل من 0.1٪ TFA مطبقة على شكل 2 × 3 مل. قم بتحميل العينة المحمضة في العمود. لا تضيف أكثر من 3 مل في المرة الواحدة. اضبط الفراغ لاستهداف حوالي 1 إلى 2 قطرات في الثانية.
5. باستخدام الماصات الزجاجية، اغسل العمود بسعة 9 مل من 0.1٪ TFA مطبق على شكل 3 × 3 مل. قم بإزالة العمود ب 2 مل من 40٪ ACN ، 0.1٪ TFA. اجمع جزأين بحجم 2 مل في أنابيب زراعة الزجاج. تجاهل العمود.
6. قم بتغطية أنابيب الشطف بالبارافيلم وقم بعمل 3-5 ثقوب على الغطاء باستخدام إبرة 20 جرام. قم بتجميد المصفاة على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى تتصلب تماما.
7. تجميد الكسور بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تأكد من جفاف العينات تماما قبل إيقاف المجفف بالتجميد. قم بتخزين الأنابيب في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع مناديل رقيقة عند -80 درجة مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية باناسونيك ام دي اف-U76V الفريزر -20 درجة مئوية VWR SCPMF-2020 دلو الدوار المتأرجح ثيرموفيشر العلمي 75004377 مشعب الفراغ ريستيك هاتف: 26080 مجفف التقويم لابكونكو 7420020 CentriVap مكثف فراغ منضدة لابكونكو 7810010 Amicon Ultra-15 وحدات تصفية الطرد المركزي ميليبور سيجما UFC901024 دوار نهاية طرف ثيرموفيشر العلمي 415110س س أنابيب ثقافة الزجاج فيشر ساينتيك 14-961-26 بارافيلم فيشر ساينتيك 13-374-12 إبرة 20 جرام دينار بحريني B305175 كيمويبس فيشر ساينتيك 06-666 أ أنبوب التبريد اللولبي ثيرموفيشر العلمي 379189 Nunc 15 مل أنابيب مخروطية ثيرموفيشر العلمي 12-565-268 أنابيب Eppendorf منخفضة البروتين إيبندورف 22431081 حقنة 3 مل دينار بحريني 309657 حمض ثلاثي فلور أسيتيك (TFA) فيشر ساينتيك بي -28904 الأسيتونيتريل (ACN) فيشر ساينتيك أ 21-1 ماء MilliQ المياه منزوعة الأيونات المستخدمة لتحضير جميع المحاليل والمخازن المؤقتة