تخصيب الفوسفوببتيد: تقنية ترسيب مناعي قائم على الأجسام المضادة لفصل الببتيدات الفسفرية المحددة عن مخاليط الببتيد المعقدة

الملخص

المصدر: Cheng، L.C.، et al. تخصيب الفوسفوببتيد إلى جانب قياس الطيف الكتلي الكمي الخالي من الملصقات للتحقيق في الفوسفوبروتيوم في سرطان البروستاتا. J. Vis. إكسب. (2018).

في هذا الفيديو ، نوضح الترسيب المناعي القائم على الأجسام المضادة للفوسفوببتيدات من خليط الببتيد. يتم تركيز الفوسفوببتيدات المخصب بالفراغ وتخزينها لتحليلها في اتجاه المصب.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الترسيب المناعي وإثراء الببتيدات pY

1. أعد تعليق المسحوق المجفف بالتجميد لهضم الببتيد المنقى مع 0.5 مل من المخزن المؤقت المرتبط بالترسيب المناعي المثلج البارد (IP) في كل جزء. قم بتجميع الكسور عن طريق نقل حجم إعادة التعليق 0.5 مل من الكسر الثاني إلى الكسر الأول وحفظ طرف الماصة. دوامة بقوة (بدلا من سحب العينة لأعلى ولأسفل) لضمان إذابة العينة تماما قبل نقلها إلى أنبوب تبريد بغطاء لولبي سعة 3.6 مل.
2. اشطف أنابيب التجميد ب 0.5 مل أخرى من مخزن المخزن المؤقت لربط IP (الجدول 1) في كل أنبوب. انقل المحلول إلى أنبوب الغطاء اللولبي سعة 3.6 مل باستخدام نفس طرف الماصة لتقليل فقد العينة. كرر الشطف 1 مرة أخرى ، مما يجعل حجم إعادة التعليق النهائي 2 مل (ل 5 مجم من البروتين). قم بقياس درجة الحموضة في العينة للتأكد من أنها حوالي 7.4. إذا كان حمضيا جدا ، أضف بشكل متكرر 10 ميكرولتر من 1M Tris (غير معاير ، درجة الحموضة ~ 11). إذا كان أساسيا جدا ، أضف بشكل متكرر 10 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المخفف (1:25 أو 1: 100).
3. اغسل حبيبات pY مسبقا (لمدة 5 ملغ من محللة البدء)
   1. هناك حاجة إلى 25 ميكروغرام من الجسم المضاد 4G10 و 12.5 ميكروغرام من الجسم المضاد 27B10.4 لكل عينة. بعد استخدام ماصة p200 ذات طرف مقطوع لنقل الأجسام المضادة إلى أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق ، اغسل الأجسام المضادة ب 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت المرتبط ب IP المثلج 2x. قم بالطرد المركزي عند 100 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية وشفط المادة الطافية.
   2. أعد تعليق الخرزات إلى تركيز مخزون يبلغ 0.5 مجم / مل باستخدام مخزن مؤقت لربط IP. (لا تقم بدوامة الخرز.) بعد اقتباس الملاط اللازم (50 ميكرولتر من ملاط الأجسام المضادة 4G10 و 25 ميكرولتر 27B10.4 ملاط الأجسام المضادة لكل عينة) في أنبوب واحد ، قم بتدوير أنابيب الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية. اغسل الجدران الجانبية بمادة طافية قبل إعادة الخرز إلى التخزين في الثلاجة.
4. أضف حبات pY المغسولة مسبقا إلى محلول العينة المعلق في أنابيب التبريد ذات الغطاء اللولبي. احتضنها عند 4 درجات مئوية على دوار من طرف إلى طرف طوال الليل.
5. ضع الأنابيب المبردة ذات الغطاء اللولبي في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل مبطن بمنديل دقيق. قم بتدوير الخرزات بحجم 100 × جم لمدة 1 دقيقة. احفظ المادة الطافية ، والتي سيتم استخدامها لإثراء ببتيدات pST.
6. أعد تعليق الخرزات باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط IP. انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل وقم بتدويرها عند 100 × جم لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية.
7. اشطف أنبوب الحضانة 3x ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط IP. انقل المحتويات إلى نفس أنبوب الطرد المركزي الدقيق في كل مرة. ثم قم بتدويرها.
8. اغسل الخرزات في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 3x باستخدام 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط IP وقم بتدويرها عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الخرزات 4x مع 450 ميكرولتر من 25 ملي مولار NH₄HCO₃ ، درجة الحموضة 7.5 ، وقم بتدويرها عند 100 × جم لمدة دقيقة واحدة. استخدم محلول NH₄HCO₃ طازج مقاس 25 ملي من المسحوق في كل مرة.
قم
9. بالطرد المركزي للحبات عند 1,500 × جم لمدة 1 دقيقة. استخدم طرف تحميل الهلام لإزالة المادة الطافية تماما عن طريق غمس طرف طرف تحميل الهلام أسفل سطح الخرز.
10. أضف 4 أضعاف حجم الخرزة البالغ 0.1٪ TFA إلى الخرزات (أي أضف 300 ميكرولتر من 0.1٪ TFA ل 75 ميكروغرام من ملاط حبة pY). اخلطيهم جيدا واحتضنوا الخليط في خلاط حراري عند 1,000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
11. انقل إعادة التعليق إلى مرشح دوران 0.2 ميكرومتر. قم بتدوير أنبوب الشطف بسرعة وانقل الحجم المتبقي إلى نفس مرشح الدوران باستخدام ماصة P10. قم بتدوير مرشح الدوران عند 850 × جم لمدة 1 دقيقة. انقل الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط بالبروتين. قم بتركيز الشفط بالمكنسة الكهربائية حتى يجف طوال الليل عند 40 درجة مئوية وبوقت تسخين 300 دقيقة < br / > ملاحظه: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. قم بتجميد العينات عند -80 درجة مئوية واستمر في وقت لاحق.

الجدول 1: المخازن المؤقتة والحلول.يوضح هذا الجدول تركيبات المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

مخزن مؤقت حجم تكوين 6 م عازلة تحلل كلوريد الجوانيدينيوم 50 مل 6 م كلوريد جوانيدينيوم ، 100 ملي مولار تريس 8.5 درجة حموضة ، 10 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين ، 40 ملي كلوروأسيتاميد ، 2 ملي أورثوفانادات الصوديوم ، 2.5 ملي بيروفوسفات الصوديوم ، 1 ملي مولار β-جليسيروفات ، 500 مجم ن-أوكتيل جليكوسيد ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 100 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم 50 مل 2.23 جم بيروفوسفات الصوديوم ديكاهيدرات ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 1 م β جليسيروفوسفات 50 مل 15.31 جم β جليسيروفوسفات ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 20 مل أضف 1 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 100٪ إلى 19 مل من الماء فائق النقاء 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 250 مل أضف 5 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 5٪ إلى 245 مل من الماء فائق النقاء المخزن المؤقت للشطف pY 250 مل 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 40٪ أسيتونيتريل ، ماء فائق النقاء إلى الحجم المخزن المؤقت للشطف pST 250 مل 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 50٪ أسيتونيتريل ، ماء فائق النقاء إلى الحجم المخزن المؤقت لربط IP 200 مل 50 ملي مولار ثلاثية درجة الحموضة 7.4 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 25 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم ، درجة الحموضة 7.5 10 مل قم بإذابة 19.7 مجم في 10 مل من الماء المعقم فائق النقاء ، ودرجة الحموضة إلى 7.5 مع 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (~ 10-15 ميكرولتر / 10 مل محلول) ، واجعله طازجا 1M عازلة فوسفات ، درجة الحموضة 7 1,000 مل 423 مل 1 م فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم ، 577 مل 1 م فوسفات هيدروجين الصوديوم المخزن المؤقت للتوازن 14 مل 6.3 مل أسيتونيتريل ، 280 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 1740 ميكرولتر حمض اللاكتيك ، 5.68 مل ماء فائق النقاء عازلة الشطف 20 مل 9 مل أسيتونيتريل ، 400 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 10.6 مل ماء فائق النقاء حل قياس الطيف الكتلي 10 مل 500 ميكرولتر أسيتونيتريل ، 200 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 9.3 مل ماء فائق النقاء المخزن المؤقت أ 250 مل 5 ملي مولار فوسفات أحادي البوتاسيوم (درجة الحموضة 2.65) ، 30٪ أسيتونيتريل ، 5 ملي كلوريد البوتاسيوم ، ماء فائق النقاء للحجم العازلة ب 250 مل 5 ملي مولار فوسفات أحادي البوتاسيوم (درجة الحموضة 2.65) ، 30٪ أسيتونيتريل ، 350 ملي كلوريد البوتاسيوم ، ماء فائق النقاء حسب الحجم 0.9٪ هيدروكسيد الأمونيوم 10 مل 300 ميكرولتر 29.42٪ هيدروكسيد الأمونيوم ، 9.7 مل ماء فائق النقاء

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجفف التقويم لابكونكو 7420020 CentriVap مكثف فراغ منضدة لابكونكو 7810010 كيمويبس فيشر ساينتيك 06-666 أ Millipore مرشح تدور 0.2 ميكرومتر ميليبور سيجما UFC30GVNB أنابيب Eppendorf منخفضة البروتين إيبندورف 22431081 مضاد للفوسفوتيروزين ، الاغاروز ، الاستنساخ: 4G10 ميليبور سيجما 16101 [ا] 27B10.4 الجسم المضاد الهيكل الخلوي حبات APY03 طقم فحص الببتيد الترمو: العلمية هاتف: 23275 نصيحة علوية شركة PolyLC TT200TIO.96 أعمدة SCX (PolySULFOETHYL A) شركة PolyLC SPESE1203 حقنة 3 مل دينار بحريني 309657 ماء MilliQ المياه منزوعة الأيونات المستخدمة لتحضير جميع المحاليل والمخازن المؤقتة حمض ثلاثي فلور أسيتيك (TFA) فيشر ساينتيك بي -28904 الأسيتونيتريل (ACN) فيشر ساينتيك أ 21-1 كلوريد البوتاسيوم فيشر ساينتيك BP366-500 حمض اللاكتيك سيجما ألدريتش 69785-250 مل هيدروكسيد الأمونيوم فيشر ساينتيك أ669S-500 قاعدة تريس فيشر ساينتيك بي ت 152-5