تخصيب الفوسفوببتيدات القائم على ثاني أكسيد التيتانيوم: طريقة للعزل الانتقائي للفوسفوببتيدات من مكتبة الببتيد

Abstract

المصدر: Cheng ، L. C. et al. تخصيب الفوسفوببتيد إلى جانب قياس الطيف الكتلي الكمي الخالي من الملصقات للتحقيق في الفوسفوبروتيوم في سرطان البروستاتا. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تخصيب الفوسفوربتيدات المستخرجة من أنسجة ورم البروستاتا القائمة على ثاني أكسيد التيتانيوم. يمكن استخدام هذه الفوسفوببتيدات المخصبة في التطبيقات النهائية مثل توصيف البروتين لفهم مسارات إشارات الخلية المشاركة في تطور سرطان البروستاتا.

Protocol

فئة

1. تخصيب ثاني أكسيد التيتانيوم من الببتيدات pY

1. أعد تعليق الفوسفوببتيدات المجففة في 200 ميكرولتر من 50٪ ACN ، 0.1٪ TFA. دوامة وطرد مركزي لها عند 10,000 × غرام لمدة 30 ثانية. كرر هذا 1x لتعليقها جيدا.
2. تحضير حبات TiO₂ الموجودة في أطراف بسعة 200 ميكرولتر عينات.
   1. اضغط برفق على الجانب الصغير من الطرف لتحريك المادة إلى هذه الغاية. اشطف الطرف بإضافة 200 ميكرولتر من 100٪ ACN ، متبوعا بقلب الطرف ونقر الطرف الصغير لتحريك السائل نحو الغطاء.
   2. باستخدام شفرة حلاقة ، اقطع الطرف الصغير من الطرف وضعه فوق أنبوب منخفض البروتين. (تجنب استخدام أنابيب البوليسترين لأن TiO₂ سوف يلتصق بجوانب الأنبوب.) قم بإزالة الغطاء وإدخال ماصة دقيقة لإخراج ACN المتبقي. كرر الغسيل مع 200 ميكرولتر من 100٪ ACN. توجد حبات TiO₂ الآن في أنبوب ربط البروتين المنخفض للخطوات التالية.
   3. التكييف المسبق TiO₂ مع 500 ميكرولتر من 100٪ ACN 2x. ماصة لخلط الخرز مع المذيب. الطرد المركزي لهم في 100 × غرام لمدة 1 دقيقة.
   4. حالة TiO₂ مع 500 ميكرولتر من 0.2 M عازلة فوسفات الصوديوم (درجة الحموضة ~ 7) 2x. اغسل الخرزات ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن 3x. نظرا لأن TiO₂ كثيف جدا ، فإن الخرزات ستستقر بسرعة.
3. أضف 400 ميكرولتر من 50٪ ACN ، 0.1٪ TFA في أنبوب ربط البروتين المنخفض ، متبوعا بإضافة 84 ميكرولتر من حمض اللاكتيك. انقل الفوسفوربتيدات المعلقة إلى أنبوب ربط البروتين المنخفض واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة باستخدام دوار من طرف إلى طرف.
4. الطرد المركزي للحبات عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة لتكبيلها. اغسلها ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن (الجدول 1) 2x وقم بتدويرها عند 100 × جم لمدة 1 دقيقة.
5. اشطف الخرزات ب 300 ميكرولتر من محلول الشطف 2x. انقلها إلى مرشح دوران 0.2 ميكرومتر. قم بتدويرها في 1,500 × جم لمدة 1 دقيقة.
6. انقل وحدة الفلتر إلى أنبوب نظيف منخفض البروتين سعة 1.5 مل. قم بإزالة المحتويات 2x مع 200 ميكرولتر من 0.9٪ NH₃ في H₂O. قم بقياس الرقم الهيدروجيني بشرائط الأس الهيدروجيني ، والتي يجب أن تكون بين 10 و 11. قم بتركيز التمهيط بالمكنسة الكهربائية ليجف طوال الليل لتبخر الأمونيا.

الجدول 1: المحاليل والحلول.يوضح هذا الجدول تركيبات المخازن المؤقتة والحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.

مخزن مؤقت حجم تكوين 6 م عازلة تحلل كلوريد الجوانيدينيوم 50 مل 6 م كلوريد جوانيدينيوم ، 100 ملي مولار تريس 8.5 درجة حموضة ، 10 ملي مولار تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين ، 40 ملي كلوروأسيتاميد ، 2 ملي أورثوفانادات الصوديوم ، 2.5 ملي بيروفوسفات الصوديوم ، 1 ملي مولار β-جليسيروفات ، 500 مجم ن-أوكتيل جليكوسيد ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 100 ملي مولار بيروفوسفات الصوديوم 50 مل 2.23 جم بيروفوسفات الصوديوم ديكاهيدرات ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 1 م β جليسيروفوسفات 50 مل 15.31 جم β جليسيروفوسفات ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 20 مل أضف 1 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 100٪ إلى 19 مل من الماء فائق النقاء 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 250 مل أضف 5 مل من حمض ثلاثي فلورو أسيتيك 5٪ إلى 245 مل من الماء فائق النقاء المخزن المؤقت للشطف pY 250 مل 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 40٪ أسيتونيتريل ، ماء فائق النقاء إلى الحجم المخزن المؤقت للشطف pST 250 مل 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 50٪ أسيتونيتريل ، ماء فائق النقاء إلى الحجم المخزن المؤقت لربط IP 200 مل 50 ملي مولار ثلاثية درجة الحموضة 7.4 ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، ماء فائق النقاء إلى الحجم 25 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم ، درجة الحموضة 7.5 10 مل قم بإذابة 19.7 مجم في 10 مل من الماء المعقم فائق النقاء ، ودرجة الحموضة إلى 7.5 مع 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (~ 10-15 ميكرولتر / 10 مل محلول) ، واجعله طازجا 1M عازلة فوسفات ، درجة الحموضة 7 1,000 مل 423 مل 1 م فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم ، 577 مل 1 م فوسفات هيدروجين الصوديوم المخزن المؤقت للتوازن 14 مل 6.3 مل أسيتونيتريل ، 280 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 1740 ميكرولتر حمض اللاكتيك ، 5.68 مل ماء فائق النقاء عازلة الشطف 20 مل 9 مل أسيتونيتريل ، 400 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 10.6 مل ماء فائق النقاء حل قياس الطيف الكتلي 10 مل 500 ميكرولتر أسيتونيتريل ، 200 ميكرولتر 5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 9.3 مل ماء فائق النقاء المخزن المؤقت أ 250 مل 5 ملي مولار فوسفات أحادي البوتاسيوم (درجة الحموضة 2.65) ، 30٪ أسيتونيتريل ، 5 ملي كلوريد البوتاسيوم ، ماء فائق النقاء للحجم العازلة ب 250 مل 5 ملي مولار فوسفات أحادي البوتاسيوم (درجة الحموضة 2.65) ، 30٪ أسيتونيتريل ، 350 ملي كلوريد البوتاسيوم ، ماء فائق النقاء حسب الحجم 0.9٪ هيدروكسيد الأمونيوم 10 مل 300 ميكرولتر 29.42٪ هيدروكسيد الأمونيوم ، 9.7 مل ماء فائق النقاء

Materials