نمذجة سرطان البروستاتا في نماذج الفئران المعدلة وراثيا: تقنية تحرير الجينات الموضعية بوساطة CRISPR / Cas9 في خلايا فص البروستاتا الأمامي للفأر

الملخص

المصدر: Riedel، M. et al. توصيل الفيروس لأدلة كريسبر إلى البروستاتا الفئران لتغيير الجينات. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو طريقة لتحرير جينات معينة في خلايا غدة البروستاتا باستخدام نظام توصيل قائم على الفيروس الغدي. يسمح هذا النهج بتغيير تقويم العظام والموضعي للتعبير الجيني باستخدام تقنية كريسبر لتطوير نماذج فئران جديدة لسرطان البروستاتا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. توصيل الفيروس إلى البروستاتا الفئرية

1. تخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق بحقنة معقمة سعة 1 مل وإبرة 27 جم × 1/2 بوصة. استخدم جرعة تخدير تبلغ 0.01 مل / غرام من وزن الجسم. إذا استمر الإجراء أكثر من 30 دقيقة ، فاستمر في التخدير عن طريق حقن 1/3 من جرعة البداية كل 30 دقيقة.
2. افحص عمق التخدير من خلال تقييم استرخاء العضلات وسحب الدواسة وردود الفعل الجفنية. عندما يلاحظ فقدان ردود الفعل ، احلق أسفل بطن.
3. قم بتغطية عيون بعناية بمرهم بيطري للعيون باستخدام قطعة قطن معقمة لمنع العمى بسبب نقص منعكس القرنية.
4. امسح البطن المحلوق بنسبة 70٪ إيثانول و 10٪ بوفيدون يود لتطهير منطقة الجراحة. افرك المنطقة الجراحية من مركز المنطقة الجراحية باتجاه المحيط.
5. قم بإجراء شق رأسي في خط الوسط السفلي للبطن بطول 1 سم تقريبا باستخدام مقص جراحي معقم.
6. ارفع الصفاق باستخدام ملقط دقيق لمنع إتلاف الأعضاء الموجودة تحته. قم بعمل شق بعناية <8 مم باستخدام مقص جراحي عبر الصفاق.
   ملاحظة: على عكس البشر ، تتكون غدة البروستاتا في القوارض من أربعة فصوص منفصلة. يتم إرفاق الفص الأمامي بالحويصلة
المنوية.
7. حرك الأنسجة الدهنية جانبا برفق للكشف عن الحويصلة المنوية. باستخدام ملقط حلقي ، ارفع الحويصلة المنوية بعناية حتى يمكن التعرف على البروستاتا الأمامية (الشكل 1).
8. حقن كمية إجمالية من محلول الفيروس 30 ميكرولتر (3 × 10¹⁰ جزيئات فيروسية) في ظهارة البروستاتا الأمامية باستخدام حقنة أنسولين 0.5 مل بإبرة 30 جم × 8 مم. قلل من التسرب وتأكد من امتصاص السائل داخل الأنسجة ، مما يشكل فقاعة صغيرة. ضع الحويصلة المنوية مرة أخرى في تجويف البطن.
9. خياطة الصفاق ب 2-3 غرز بسيطة متقطعة باستخدام 6-0 خيوط قابلة للامتصاص بدائرة 13 مم و 3/8 وإبرة مدببة.
10. قم بتدبيس الجلد بثلاثة مشابك معقمة مقاس 4.8 × 6.5 مم لرفع الجلد بالملقط لتجنب إتلاف الصفاق.
11. للتعافي بشكل أفضل ، ضع ترياق التخدير بجرعة 0.01 مل / غرام من وزن الجسم عن طريق الحقن داخل الصفاق باستخدام حقنة معقمة 1 مل وإبرة 27 جم × 1/2 بوصة. ضع بعناية في قفصه.

النتائج

الشكل 1: توضيح للإجراء. يتم تنفيذ الإجراء في ماوس Rosa26-LSL-Cas9-EGFP الذي تم إنشاؤه بواسطة Platt et al. ترتبط البروستاتا الأمامية (AP) بالحويصلة المنوية (SV). يتم حقن جزيئات الفيروس التي تعبر عن دليل الحمض النووي الريبي وبروتين Cre في البروستاتا الأمامية لتغيير التعبير الجيني.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات B6J.129(B6N)-GT(ROSA)26Sor ^{tm1(CAG-cas9*,-}
^{EGFP)Fezh} / J الفئران مختبر جاكسون هاتف: 26175 0,5 مل U-100 حقنة أنسولين دينار بحريني 324825 لحقن الفيروسات حقنة 1 مل دينار بحريني 300013 لحقن التخدير 30 جم 1/2 '' إبرة دينار بحريني 304000 لحقن التخدير 6-0 خياطة Polysorb ميدترونيك GL889 لإغلاق الصفاق ستارة الجراحة المعقمة التي يمكن التخلص منها موردين متعددين وسادة التدفئة موردين متعددين بوفيدون اليود الإعدادية الوسادة فيشر ساينتيك 06-669-70 آلة التشذيب أسكولاب جي تي 415 لحلاقة البطن ملقط دومون ف.س.ت 11252-00 حامل إبرة هالسي مايكرو ف.س.ت 12500-12 مقص القزحية ف.س.ت 14094-11 ملقط نمط ضيق ف.س.ت 11002-12 ملقط الحلقة ف.س.ت 11106-09 مقبض نظام مشبك الجرح بما في ذلك
مشابك ف.س.ت 12030-01 لإغلاق الجلد مزيل نظام مشبك الجروح ف.س.ت 12030-04 1x برنامج تلفزيوني جيبكو 10010-023 أنتيسيدان تم الحصول عليها من منشأة بوتورفانول تم الحصول عليها من منشأة ميديتوميدين هيدروكلوريد تم الحصول عليها من منشأة ميدازولام تم الحصول عليها من منشأة 100٪ إيثانول فيشر ساينتيك 22-032-103 مرهم العين تاكيدا 7242 ريال فيروس (AAV ، AV) موردين متعددين الفيروس المستخدم في هذا البروتوكول هو إنتاج داخلي