تحويل ثنائي الكبريتيت للحمض النووي الجيني: طريقة لدراسة مثيلة الحمض النووي في عينات الحمض النووي الجينومي من أنسجة سرطان الجهاز الهضمي

الملخص

المصدر: Bonetto, A. et al. الفأر الحامل لورم سرطان القولون 26 كنموذج لدراسة دنف السرطان. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو إجراء تعديل ثنائي الكبريتيت للحمض النووي الجيني من عينات سرطان الجهاز الهضمي. هذه التقنية مفيدة للتحقيق في العلاقة بين أنماط مثيلة الجينات وإثبات مساهمتها في التسرطن.

البروتوكول

فئة

1. معالجة ثنائي الكبريتيت

1. استخدم 45 ميكرولتر من محلول الأنسجة المهضومة كعينة.
2. قم بإجراء معالجة ثنائي الكبريتيت باستخدام الكواشف في مجموعة تحويل ثنائي الكبريتيت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
   1. أضف 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف إلى عينة الحمض النووي واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (انظر جدول المواد).
   2. أثناء احتضان العينات ، قم بإعداد كاشف تحويل ثنائي الكبريتيت بإضافة 750 ميكرولتر من dH₂O و 210 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخفيف إلى أنبوب واحد من كاشف تحويل التصوير المقطعي المحوسب (انظر جدول المواد). امزج الأنابيب عن طريق الدوامة لمدة 10 دقائق.
   3. بعد الحضانة لمدة 15 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من كاشف تحويل التصوير المقطعي المحوسب المحضر إلى كل عينة واخلطها عن طريق الانعكاس.
   4. احتضان العينات في الظلام عند 50 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة.
   5. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات وضعها على الجليد لمدة 10 دقائق.
   6. أضف 400 ميكرولتر من مخزن الربط واخلط كل عينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل (انظر جدول المواد). قم بتحميل كل عينة في عمود دوران وضع العمود في أنبوب تجميع سعة 2 مل (انظر جدول المواد).
   7. جهاز الطرد المركزي كل عينة بأقصى سرعة (10،000 × جم) لمدة دقيقة واحدة وتخلص من التدفق.
   8. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى كل عمود وقم بالدوران بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة ، مع التخلص من التدفق (انظر جدول المواد).
   9. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإزالة الكبريت إلى كل عمود واترك العمود يقف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (انظر جدول المواد). بعد الحضانة ، قم بتدوير الأعمدة بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة وتخلص من التدفق.
   10. أضف 200 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل عمود وقم بالدوران بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة (انظر جدول المواد).
   11. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
   12. أضف 46 ميكرولتر من dH₂O إلى كل عمود وضع كل عمود في أنبوب بولي بروبيلين معقم جديد 1.5 مل للاستخدام مرة واحدة (انظر جدول المواد). قم بتدوير كل أنبوب لمدة دقيقتين لمسح الحمض النووي.
3. قم بإزالة كل عمود دوران من أنبوب البولي بروبلين أحادي الاستخدام وتخلص منه (انظر جدول المواد). الحمض النووي جاهز الآن للتحليل.

< p class = "jove_title" >2. تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة الكمية (qMSP)

1. استخدم الحمض النووي المعدل بثنائي الكبريتيت من الخطوة 1.3 كقالب ل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي القائم على التألق في qMSP لتقييم مثيلة منطقة المحفز في كل تحليل جيني.
2. قم بإجراء qMSP باستخدام أداة PCR في الوقت الفعلي 96 بئرا (انظر جدول المواد).
   1. تحقق من حالة مثيلة المحفز للجين المستهدف على الحمض النووي المعدل بثنائي الكبريتيت باستخدام برايمر أمامي 200 نانومتر ، وبرايمر عكسي 200 نانومتر ، ومجسات 80 نانومتر. قم بإعداد المزيج الرئيسي مع 16.6 ملي مولار (NH₄) ₂SO₄ ، 67 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 8.8 ، 10 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول ، 10 نانومتر فلورسين ، 0.166 ملي مولار من كل ثلاثي فوسفات ديوكسي نوكليوتيد ، و 0.04 وحدة / ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي (انظر جدول المواد). حجم التفاعل النهائي في كل بئر لجميع المقايسات هو 25 ميكرولتر.
   2. قم بإجراء دورة qMSP على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، متبوعة ب 55 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة ، و 72 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة < / > ملاحظة: يجب اختيار الجين المستهدف بناء على معايير وجود قيم بيتا أكبر ، وارتباطه بجزر CpG في منطقة المروج ، وأنه مناسب لتصميم التمهيدي والمسبار ل qMSP.
3. استخدم الجينوم البشري المعالج ب CpG Methylase (M.SssI) كعنصر تحكم إيجابي في المثيلة (انظر جدول المواد).
   ملاحظه: يتم تعريف القياس الكمي النهائي للمثيلة على أنه قيمة المثيلة النسبية (RMV) ويتم حسابه على أنه ^2-ΔΔCt لكل تكرار للكشف عن المثيلة مقارنة بمتوسط Ct ل β-Actin (ACTB). يتم عرض تسلسل التمهيدي والمسبار في الجدول 1. يتم استخدام Ct 100 للتكرارات غير المكتشفة ، والتي تعطي قيمة ^2-ΔΔCt قريبة من الصفر. يتم استخدام الصيغة التالية:
   يعني ^2-ΔΔCt (RMV) = (^2-ΔΔ Ct_replicate_1 + ^2-ΔΔ Ct_replicate_2 + ^2-ΔΔ Ct_replicate_3) / 3.

الجين إلى الأمام 5 '- 3' عكس 5 '- 3' مجس ب أكتين وسم GGA GTA TAT AGG TTG GGG AAG TT AAC ACA CAA TAA CAA ACA CAA ATT CAC \ 56-FAM \ TGT GGG GTG \ ZEN \ GTG ATG GAG GAG GTT TAG \ 3IABkFQ \ EPB41L3 GGG ATA GTG GGG TTG ACG C ATA AAA ATC CCG ACG AAC GA AAA TTC GAA AAA CCG CGC GAC GAC GCC GAA ACC A

المواد