الحفظ بالتبريد القائم على التزجيج: تقنية تبريد فائقة السرعة للحفاظ على العينات البيولوجية في درجات حرارة منخفضة جدا للتخزين طويل الأجل

الملخص

المصدر: Lu و J. H. et al. إنشاء نماذج الطعم الغريب المشتق من مريض سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح طريقة تزجيج بالتبريد فائقة السرعة للحفاظ على العينات البيولوجية. تستلزم الطريقة استخدام مجموعة من المواد الواقية من الفراغات بالتبريد لحماية الأنسجة البيولوجية من تلف التجمد عن طريق منع تكوين بلورات الجليد داخل الخلايا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. حفظ الأنسجة بالتبريد

ملاحظة: يشير هذا الجزء بشكل أساسي إلى طرق مجموعة Live Tissue Kit Cryo. يتم سرد المجموعات والمعدات الرئيسية في جدول المواد.

1. قتل الفئران بطريقة معتمدة من IRB عندما يكون قطر الورم أكبر من 10 مم.
2. باستخدام ملقط ومقص معقم، اعزل الورم ببطء عن الفئران.
3. اغسل أنسجة الورم باستخدام DPBS في طبق 10 سم. قم بتشريح وإزالة المناطق النخرية والأنسجة الدهنية والجلطات الدموية والأنسجة الضامة بالملقط والمقص.
4. قطع أنسجة الورم بحد أقصى 1 مم بسماكة بقالب.
5. اغسل الشرائح ب DPBS في طبق 10 سم .
   ملاحظه: تتضمن عملية التزجيج استخدام أنابيب تحمل علامة V1 / V2 / V3 في الخطوات 1.6-1.8. المكونات الرئيسية هي DMSO والسكروز.
6. انقل الشرائح إلى الأنبوب V1 بالملقط واحتضان الأنبوب عند 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق. قم بلف الأنبوب ورأسه لفترة وجيزة ، وضعه عند 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق أخرى.
7. يسكب محلول V1 ويقطع إلى شرائح في طبق 10 سم. انقل الشرائح إلى الأنبوب V2 بالملقط ، واحتضن الأنبوب V2 عند 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق. قم بلف الأنبوب وقلبه لفترة وجيزة ، وضعه على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق أخرى.
8. يسكب محلول V2 ويقطع في طبق 10 سم. انقل الشرائح إلى الأنبوب V3 بالملقط ، واحتضن الأنبوب عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. قم بلف الأنبوب وقلبه لفترة وجيزة ، وضعه على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل. تأكد من أن الشرائح كلها تغرق في قاع الأنبوب.
   1. إذا ظلت عدة شرائح عائمة ، فقم بلف الأنبوب وقلبه لفترة وجيزة ، ثم ضع الأنبوب عند 4 درجات مئوية مرة أخرى حتى تغرق جميع الشرائح تماما ؛ إذا لزم الأمر ، تخلص من الشرائح العائمة.
9. يسكب محلول V3 ويقطع إلى طبق 10 سم.
10. قطع حاملات المناديل إلى الطول المناسب ووضعها على شاش معقم. انقل الشرائح إلى الحوامل. لف الحوامل بالشاش وضعها في النيتروجين السائل باستخدام الملقط ، متبوعا بالحضانة لمدة 5 دقائق.
11. قم بتسمية القوارير المبردة بمعلومات الأنسجة.
12. انقل الحوامل مع شرائح المناديل إلى قوارير مبردة مخزنة في النيتروجين السائل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجموعة المناديل الحية Cryo Kit سيليفر للتكنولوجيا الحيوية ، شنغهاي ، الصين LT2601 القوالب المعالجة بالأنسجة والشفرات المساعدة سيليفر للتكنولوجيا الحيوية ، شنغهاي ، الصين LT2603 DPBS Basalmedia Technology ، شنغهاي ، الصين L40601