تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان وتم استعراضها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
فئة
1. عزل LDN من غسل تجويف البطن
- الحصول على عينة
قم - بضخ 1,000 مل من محلول ملحي معقم طبيعي مباشرة في تجويف البطن قبل إغلاق الجرح لدى المرضى الذين خضعوا لعملية جراحية في البطن بسبب الأورام الخبيثة المعدية المعوية.
ملاحظه: تم الحصول على عينات من المرضى الذين خضعوا لاستئصال المعدة أو استئصال القولون أو استئصال المريء دون تحيز على أساس العمر أو الجنس. تم نقل المحلول الملحي إلى وعاء وسكبه في البطن بالكامل في غضون دقيقة واحدة. يتم إجراء هذا بشكل روتيني كغسل بريتوني بعد الجراحة دون آثار كبيرة على المرضى.
- اغسل تجويف البطن على نطاق واسع لمدة 1 دقيقة على الأقل < br / >
ملاحظه: يوصى بتقليب السائل المنقوع ببطء باستخدام يدي الجراح حتى تكون العينات موحدة.
- استرجع 200 مل من سائل الغسيل بأربع محاقن سعة 50 مل.
ملاحظه: في بعض الأحيان ، يتم استخدام موصل مطاطي لامتصاص السوائل.
- قم بتنقية LDN البريتوني باستخدام mAb الخاص بالخلايا المحببة ، CD66b
ملاحظه: نظرا لأن الطبقة الوسيطة بعد الطرد المركزي المتدرج للكثافة تحتوي على العديد من الخلايا أحادية النواة ، فقد تم إجراء اختيار إيجابي للعدلات متعددة الأشكال باستخدام CD66b mAb.
- نقل سائل الغسيل البريتوني إلى أنبوب سعة 50 مل.
ملاحظه: في هذه الخطوة ، قم بتمرير السوائل عبر مرشح نايلون 100 ميكرومتر لإزالة الشوائب.
- الطرد المركزي للسائل البريتوني عند 270 × جم لمدة 7 دقائق في RT.
- أعد تعليق الكريات في 5 مل من PBS مع 0.02٪ EDTA.
- قم بتراكب 5 مل من تعليق الخلية بعناية على محلول تدرج بكثافة 3 مل.
- جهاز طرد مركزي عند 1,700 × جم لمدة 15 دقيقة عند RT دون أي انقطاع.
- احصد حوالي 2 إلى 3 مل من محلول يحتوي على الطبقات الوسيطة (الشكل 1 أ) باستخدام ماصة واخلطه مع 10 مل من PBS مع 0.02٪ EDTA.
قم - بالطرد المركزي للسائل البريتوني عند 400 × جم لمدة 7 دقائق عند RT وتخلص من المادة الطافية.
- أضف 10 مل أخرى من PBS مع 0.02٪ EDTA وجهاز طرد مركزي عند 270 × جم لمدة 7 دقائق في RT.
- قم بإذابة حبيبات الخلية (1 × 107) في 60 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمجموعة فصل الخلايا المغناطيسية.
- أضف 20 ميكرولتر من كتلة Fc إلى الكريات واحتضانها لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أضف 20 ميكرولتر من مضاد CD66b المترافق مع الميكروبيدات واحتضانه لمدة 10 دقائق إضافية عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الكريات وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS.
- قم بتطبيق تعليق الخلية على عمود مغناطيسي في المجال المغناطيسي لفاصل مغناطيسي مناسب واجمع خلايا التدفق المحتوية على CD66b (-) عن طريق غسل العمود ب 15 مل من المخزن المؤقت.
- قم بإزالة العمود من الفاصل المغناطيسي وقم على الفور بإخراج خلايا CD66b (+) المصنفة مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس بقوة في العمود.
ملاحظه: يتكون عدد خلايا CD66b (+) في الغالب من العدلات كما هو محدد من خلال تحليل FACS ، مما يشير إلى أن >95٪ من جزء CD66 (+) إيجابي ل CD11b و CD15 و CD16 ، ولكنه سلبي ل CD14.
