مقالة منهجية

الفحص المجهري الفلوري لمصائد العدلات خارج الخلية أو NETs: تقنية لمراقبة التفاعل اللاصق بين الخلايا السرطانية و NETs

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kanamaru, R. et al. مصائد العدلات خارج الخلية الناتجة عن العدلات منخفضة الكثافة التي تم الحصول عليها من سائل الغسيل البريتوني تتوسط نمو الخلايا السرطانية والتعلق بها. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تلطيخ الفلورسنت لمصائد العدلات خارج الخلية (NETs) ، وهي مكونات الحمض النووي خارج الخلية التي تطردها العدلات. تتيح هذه التقنية تصور التفاعل اللاصق بين الخلايا السرطانية و NETs.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. تلطيخ الخلايا السرطانية بصبغة رابط الخلايا الفلورية الحمراء

  1. تحضير خطوط الخلايا السرطانية البشرية MKN45 و NUGC و OCUM-1.
  2. اغسل 1 × 107 خلايا باستخدام PBS + 0.02٪ EDTA في أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي بحجم 270 × جم لمدة 7 دقائق في RT.
  3. أضف 1 مل من محلول تلطيخ الصبغة إلى الكريات والماصة برفق.
  4. قم بإذابة 4 ميكرولتر من صبغة رابط الخلايا الفلورية الحمراء في 1 مل من المحلول للتلوين وتخلط مع تعليق الخلية من الخطوة 1.2.
  5. احتضان الكريات لمدة 4 دقائق في RT.
  6. أضف 4 مل من DMEM (10٪ FBS) لإيقاف تفاعل التلوين.
  7. جهاز طرد مركزي 270 × جم لمدة 7 دقائق وتخلص من المادة الطافية.
  8. كرر الخطوتين 1.6 و 1.7 مرتين.
  9. تحقق باستخدام المجهر الفلوري (الإثارة = 551 نانومتر ، ينبعث منها = 567 نانومتر) من أن الخلايا السرطانية ملطخة باللون الأحمر.
< p class = "jove_title" >2. تحليل التصاق الخلايا السرطانية ب NETs

  1. زراعة خلايا العدلات منخفضة الكثافة في صفيحة مطلية ب 6 آبار بولي إل ليسين (قطرها 6 سم) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، مما يتيح إنتاج مصائد العدلات خارج الخلية أو NETs
  2. نقل الخلايا السرطانية الحمراء الملطخة بالفلورسنت (1 × 106) في 1 مل من RPMI 1640 مكملة بنسبة 0.1٪ BSA.
  3. أضف الخلايا السرطانية إلى مزرعة LDN التي أنتجت NETs.
  4. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، مما يمكن الخلايا السرطانية من الاتصال ب NETs.
    ملاحظه: تحفز الحضانة الطويلة التصاق الخلايا السرطانية ب LDN أو بالصفائح.
  5. قم بإزالة الوسط وغسل الآبار برفق عن طريق إضافة 2 مل من الوسائط الدافئة مسبقا (0.1٪ BSA + RPMI 1640) وتحريك الطبق.
  6. كرر إجراء الغسيل في الخطوة 2.5 مرتين.
    ملاحظه: نظرا لأن NETs تعلق بشكل ضعيف على اللوحة ، يجب أن يتم الغسيل بلطف قدر الإمكان لتجنب إزالة NETs نفسها.
  7. أضف صبغة الفلورسنت الخضراء لتلوين النواة والكروموسومات بتركيز نهائي قدره 5 ميكروغرام / مل لتصور الشبكات الشبكية.
  8. راقب NETs والخلايا السرطانية المرفقة باستخدام المرشحات المناسبة (أخضر ، إثارة = 504 نانومتر ، انبعاث = 523 نانومتر ؛ أحمر ، إثارة = 551 نانومتر ، انبعاث = 567 نانومتر).
  9. ادمج الأشكال لإظهار الخلايا السرطانية المحاصرة بواسطة NETs.
    ملاحظه: في بعض التجارب ، تمت إضافة إنزيم تحلل الحمض النووي إلى مزرعة LDN (التركيز النهائي 100 U / mL) قبل 5 دقائق من الحضانة المشتركة لمدة 5 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات SYTOX محلول بقعة الحمض النووي الأخضر 5 ملي مولار في DMSO ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية S7020 طقم ربط الخلايا الفلورية الحمراء PKH26 لوضع العلامات العامة على غشاء الخلية سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية ص 9691 RPMI1640 متوسط سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية R8758 مسحوق ألبومين مصل البقر المجفف بالتجميد ، ≥96٪ (الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 2153 بولي إل ليسين مطلي ب MICROPLATE 6Well إيواكي، اليابان 4810-040 المجهر المجهري الفلورسين BX8000 ، Keyence ، أوساكا اليابان BZ-X710 MKN45 خط خلايا سرطان المعدة البشري Riken ، توكوبا اليابان غير متاح NUGC-4 خط خلايا سرطان المعدة البشري Riken ، توكوبا اليابان غير متاح خط خلايا سرطان المعدة البشري OCUM-1 جامعة مدينة أوساكا ، اليابان غير متاح هدية من الدكتور م. ياشيرو DNase I ورثينجتون ، ليكوود نيوجيرسي LS002138 0.5 مول / لتر محلول EDTA (درجة الحموضة 8.0) ناكالاي تيسك ، اليابان 06894-14 النسر المعدل للجلوكوز المتوسط والمرتفع من Dulbecco (DMEM) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية د5796

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NET RPMI 1640

مقالات ذات صلة