الفحص المجهري الفلوري بفاصل زمني لمصائد العدلات خارج الخلية أو NETs: تقنية لتحليل تفاعل ما بعد الالتصاق بين الخلايا السرطانية و NETs

الملخص

المصدر: Kanamaru, R. et al. مصائد العدلات خارج الخلية الناتجة عن العدلات منخفضة الكثافة التي تم الحصول عليها من سائل الغسيل البريتوني تتوسط نمو الخلايا السرطانية والتعلق بها. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نقوم بتحليل سلوك ما بعد الالتصاق للخلايا السرطانية المحاصرة في مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) عن طريق الزراعة المشتركة للعدلات منخفضة الكثافة وخلايا سرطان المعدة. يساعد تحليل الفيديو بفاصل زمني في مراقبة الأحداث الخلوية المختلفة ودراسة دور NETs في الحالات المرضية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحليل فيديو الفاصل الزمني للخلايا السرطانية المحاصرة

1. استزراع LDNs البريتونية في طبق دائري 35 مم مغطى ب poly-L-lysine واحتضانه لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
2. أضف صبغة الفلورسنت الخضراء لتلوين النواة والكروموسومات لتصور الشبكات عند التركيز النهائي البالغ 5 ميكرومتر.
3. بعد 1 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة الوسائط وأضف 2 مل من 0.1٪ BSA + RPMI 1640.
4. قم بإزالة الوسائط وأضف 1 × 10⁶ خلايا MKN45 غير ملوثة معلقة في 0.1٪ BSA + RPMI 1640. احتضن لمدة 5 دقائق في RT.
5. قم بإزالة أي خلايا سرطانية غير متصلة عن طريق غسل الطبق برفق عن طريق إضافة 2 مل من الوسائط الدافئة مسبقا (0.1٪ BSA + RPMI 1640) وتحريك الطبق.
6. كرر إجراء الغسيل أعلاه مرتين.
   ملاحظه: نظرا لأن NETs تعلق بشكل ضعيف على اللوحة ، يجب أن يتم الغسيل بلطف قدر الإمكان لتجنب إزالة NETs نفسها.
7. أضف DMEM مع 10٪ FCS مكمل ب 100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين.
8. قم بتركيب طبق الثقافة في نظام مراقبة خلية كامل الرؤية وحدد المجال المناسب الذي يتم فيه احتجاز الخلايا السرطانية بواسطة NETs.
9. استمر في الزراعة المشتركة لمدة يومين إضافيين والتقاط صور مستمرة للحقل كل 6 دقائق تحت الضوء العادي والمضان ، والذي يكتشف خلايا MKN45 و NETs ، على التوالي.
10. قم بتركيب الصور في كل نقطة زمنية وقم بإنشاء مقاطع فيديو بفاصل زمني باستخدام برنامج Image Viewer.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات SYTOX محلول صبغة الحمض النووي الأخضر 5 ملي في DMSO ثيرمو فيشر العلمي ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية S7020 RPMI1640 متوسط سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية R8758 النسر المعدل للجلوكوز المتوسط والمرتفع من Dulbecco (DMEM) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية د5796 محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية د8537 مصل الأبقار الجنينية، مناطق مؤهلة ومعتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية gibco من Life Technologies ، المكسيك هاتف: 10437-028 مسحوق ألبومين مصل البقر المجفف بالتجميد ، ≥96٪ (الرحلان الكهربائي لجل الاغاروز) سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية أ 2153 البنسلين ستربتومايسين لايف تكنولوجيز اليابان 15140-122 بلازما وقائية InvivoGen ، سان دييغو ، كاليفورنيا - الولايات المتحدة الأمريكية أنت-MPP المجهر المجهري الفلورسين BX8000 ، Keyence ، أوساكا اليابان BZ-X710 نظام مراقبة خلية العرض الكامل نيكون ، كاناغاوا ، اليابان استوديو حيوي (BS-M10) MKN45 خط خلايا سرطان المعدة البشري Riken ، توكوبا اليابان غير متاح