تحضير كتلة الإكسوزوم: بروتوكول للحفاظ على الإكسوسومات من خلايا سرطان القولون البشرية المستنبتة

الملخص

المصدر: Jung ، M. K. et al. إعداد العينة وتصوير الإكسوسومات عن طريق المجهر الإلكتروني المنقول. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو تقنية تحضير كتل الإكسوسوم من الخلايا السرطانية المعدية المعوية المزروعة. يمكن أيضا تقطيع كتل الإكسوسوم هذه إلى شرائح وتلطيخها وتصويرها لتحديد موضع بروتينات معينة في حويصلة ثنائية الطبقة الدهنية.

البروتوكول

1. كتلة تحضير الإكسوسومات

1. حبيبات الإكسوسومات من طاف مزرعة خلايا HCT116 عن طريق الطرد المركزي عند 100,000 × جم لمدة 1.5 ساعة. قم بإزالة المادة الطافية للثقافة وإصلاح حبيبات الإكسوسوم المنقاة بعناية مع 1 مل من 2.5٪ جلوتارالديهايد في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M (الرقم الهيدروجيني 7.0) لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. ل 0.1 M كاكوديلات الصوديوم ، قم بإذابة 4.28 جم من حمض الكاكوديليك في 160 مل من الماء المقطر (DW). اضبط درجة الحموضة على 7.4 مع 0.1 مل حمض الهيدروكلوريك ، ثم اصنع ما يصل إلى 200 مل بالماء المقطر.
2. قم بإزالة المثبت واشطف الكريات ب 1 مل من محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M في درجة حرارة الغرفة. كرر ثلاث مرات ، مع كل تغيير يستمر لمدة 10 دقائق.
3. بعد إصلاح العينة ب 1 مل من رابع أكسيد الأوزميوم 2٪ لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
4. قم بإزالة المثبت واشطفه ثلاث مرات باستخدام محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M كل 10 دقائق.
5. احتضن لمدة 10 دقائق بسلسلة الأسيتون المتدرجة (50٪ ، 60٪ ، 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 95٪ ، 100٪ على التوالي) على شاكر.
6. قم بإزالة الأسيتون واحتضان محلول الأسيتون 3: 1: خليط تضمين منخفض اللزوجة لمدة 30 دقيقة. حبيبات الإكسوسوم في الأنبوب.
7. قم بإزالة الوسط وأضف 1: 1 الأسيتون: وسط خليط تضمين منخفض اللزوجة ، ثم احتضانه لمدة 30 دقيقة.
8. قم بإزالة الوسط وأضف 1: 3 الأسيتون: وسط خليط تضمين منخفض اللزوجة ، ثم احتضانه لمدة 30 دقيقة.
9. قم بإزالة الوسط وأضف خليط التضمين منخفض اللزوجة بنسبة 100٪ واحتضانه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
10. قم بتضمين العينة في خليط تضمين نقي منخفض اللزوجة باستخدام قالب التضمين واخبزها لمدة 24 ساعة عند 65 درجة مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الجلوتارالديهايد EMS 16200 كاكوديلات الصوديوم EMS 12300 ريال رابع أكسيد الأوزميوم 1 جم كريستال EMS 19100 استخدم فقط في غطاء الدخان أسيتون جونسي 1ب 2031