تلطيخ الذهب المناعي للأقسام الخارجية اللونية: تقنية لتصور العلامات التشخيصية في التجويف الإغراوي

الملخص

المصدر: Jung، M.K.، Mun، J. Y. تحضير عينة وتصوير الإكسوسومات عن طريق المجهر الإلكتروني المنقول. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نوضح تلوين مناعي الذهب للمؤشرات الحيوية الموضعية داخل منطقة التجويف للأقسام الخارجية فائقة النحافة. تتيح هذه التقنية التشخيص المبكر للأمراض عن طريق تصور الجزيئات المستهدفة داخل الإكسوسومات التي تفرزها الخلايا المريضة.

البروتوكول

1. تلطيخ مناعي لأقسام الإكسوسوم والتصوير

1. قم بإعداد أقسام فائقة النحافة 60 نانومتر من كتلة الإكسوسوم باستخدام ميكروتوم فائق وجمعها على شبكة نيكل.
2. احتضان الشبكات في قطرات 50 ميكرولتر من 0.02 م جلايسين لمدة 10 دقائق لإخماد مجموعات الألدهيد الحرة.
3. اشطف في 100 ميكرولتر من DW ثلاث مرات لكل منها لمدة 10 دقائق. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في PBS الذي يحتوي على 1٪ BSA.
4. احتضان الشبكات في قطرات 50-100 ميكرولتر من الجسم المضاد ل KRS (1: 100 في PBS يحتوي على 0.1٪ BSA) لمدة ساعة واحدة (إذا لزم الأمر ، يجب تنفيذ هذه الخطوة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.)
5. اغسل الشبكات بخمس قطرات منفصلة (50 ميكرولتر) من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 10 دقائق لكل منها.
6. انقل الشبكات إلى قطرات من الجسم المضاد الثانوي لمدة 1 ساعة (مضاد للأرانب IgG مترافق مع جسيم ذهبي 10 نانومتر (1: 100) في PBS يحتوي على 0.1٪ BSA).
7. اغسل الشبكات بخمس قطرات منفصلة (50 ميكرولتر) من PBS تحتوي على 0.1٪ BSA كل 10 دقائق.
8. صبغة مزدوجة مع 2٪ أسيتات اليورانيل لمدة 20 دقيقة في الظروف المظلمة ومع سترات رينولد الرصاص لمدة 10 دقائق على التوالي.
9. راقب الشبكات تحت المجهر الإلكتروني للإرسال عند 80 كيلو فولت.
10. انقر فوق "اكتساب" ثم انقر فوق "ملف" و "حفظ باسم" في نظام كاميرا CCD ضمن TEM عند 80 كيلو فولت. يتبع وقت التعرض الإعدادات التلقائية.

المواد