$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. تجميد العضلات وتركيبها
- اغمر النصف السفلي من دورق بلاستيكي صغير (50 مل) يحتوي على الأيزوبنتان في النيتروجين السائل. يكون الأيزوبنتان جاهزا للاستخدام عندما يصبح لزجا قليلا ويشكل صفائح بيضاء صلبة تبطن الجزء الداخلي من الدورق (درجة الحرارة: -160 درجة مئوية).
ملاحظه: استخدم دائما أدوات يدوية من البرونز أو الألومنيوم غير المثيرة. تجنب استنشاق بخار المنتج. استخدم مع تهوية كافية. إذا كان التعامل مع الانسكاب والتهوية مستحيلا أو غير عملي ، فاستخدم جهاز تنفس مناسب.
- قم بتجميد بعض وسيط التضمين على ظرف (الفلين) عن طريق غمسه لفترة وجيزة (10 ثوان) في الأيزوبنتان.
- تعامل مع العضلة (على سبيل المثال ، الظنبوب أو المعدة) عن طريق إمساكها بالوتر ، عموديا بالنسبة للفلين ، من أجل الحفاظ على اتجاه الألياف والسماح بالمقاطع العرضية.
- ضع الجزء النهائي من العضلة الطازجة بعناية فوق وسط التضمين المجمد.
ملاحظه: سوف تلتصق العضلات. من المهم عدم إحاطة العضلات تماما بوسيط التضمين. من المهم أيضا الحفاظ على الاتجاه الرأسي لتحديد منطقة المقطع العرضي لاحقا.
- اغمس ظرف الظرف مع العضلة المرفقة في حمام الأيزوبنتان (وقت التجميد المعتاد هو 7-15 ثانية ، اعتمادا على حجم العينة وتكوينها).
ملاحظه: يجب ألا يستمر الغمر في محلول التجميد أكثر مما هو مطلوب لتجميد العينة تماما. سيؤدي التجميد لفترة طويلة إلى كسر كتلة الأنسجة ، في حين أن الوقت القصير جدا سيؤدي إلى تكوين بلورة الجليد. ستكون العينة المجمدة جيدا بيضاء طباشيرية.
- بعد تجميد العينة ، ضعها في كيس بلاستيكي صغير أو أنبوب عينة (50 مل) وقم بتخزينها على الفور في فريزر عميق عند -80 درجة مئوية أو في النيتروجين السائل.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. تقطيع العضلات
- اضبط درجة حرارة العمل للغرفة الداخلية الناظمة على حوالي -23 درجة مئوية.
- اسمح للعينة (المخزنة مسبقا عند -80 درجة مئوية) بالتأقلم عند درجة حرارة العمل (يجب أن تكون بضع ساعات كافية).
- قم بقص أجزاء متعددة بسمك 8 ميكرومتر من العينة (يفضل أن تكون عضلات الظنبوب الأمامية أو عضلات المعدة) واجمعها على شرائح زجاجية.
ملاحظه: قطع القسم في منطقة منتصف البطن من العضلات. أيضا ، من أجل الدقة ، قم بقص الأقسام بشكل عمودي على محور التثبيت.
- احتفظ بالشرائح الزجاجية داخل حجرة ناظم البرد. لا تدعها تذوب إذا كان الهدف هو إجراء دراسات IF / IHC أو التلوين الأنزيمي.
- قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية لمزيد من التحليلات.