عزل الخلايا أحادية النواة Lamina Propria: تقنية طرد مركزي متدرج الكثافة القائمة على السيليكا للحصول على خلايا أحادية النواة من القولون الفئران

الملخص

المصدر: McManus ، D. et al. عزل الخلايا أحادية النواة الصفيحة المخصوصة من القولون الفئراني باستخدام الكولاجيناز E. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح عزل الخلايا أحادية النواة الصفيحة المخصوصة عن أنسجة القولون الفئران عن طريق الهضم الأنزيمي باستخدام الكولاجيناز E وفصل وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا. يمكن استخدام الخلايا أحادية النواة المعزولة للتحليل اللاحق

.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. إعداد الحلول

1. كما هو موضح في الجدول 1 ، قم بإعداد المخزن المؤقت للقولون ، ووسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا 100٪ ، ووسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا 66٪ ، ووسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا 44٪ ، والكولاجيناز E Digest Buffer ، و FACS Buffer.
   1. قم بإعداد محلول القولون في اليوم السابق للإجراء وتخزينه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   2. قم بإعداد وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا بنسبة 100٪ في اليوم السابق للإجراء وتخزينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية ، مع وضعها في درجة حرارة الغرفة في صباح يوم الإجراء لإذابة الجليد.
   3. تحضير 66٪ و 44٪ من وسائط الفصل القائمة على السيليكا في صباح يوم العزل ، باستخدام وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا بنسبة 100٪ في درجة حرارة الغرفة ومحلول القولون.
   4. قم بقياس الكمية المناسبة من الكولاجيناز E المشتق من المطثية والهيستوليتيكوم وتخزينها عند -20 درجة مئوية طوال الليل قبل الإجراء. في صباح اليوم التالي ، قم بإذابة الحجم المناسب من Colon Buffer لاشتقاق Collagenase Digest Buffer. بالنسبة لجميع الحضانات باستخدام Collagenase Digest Buffer في يوم الإجراء ، قم بتسخين المحاليل مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
2. بالنسبة لخطوات البروتوكول بأكملها ، احتفظ بجهاز طرد مركزي واحد عند 20 درجة مئوية وسرعة دوران 859 × جم ، مع تعطيل الفرامل (0 تباطؤ) للطرد المركزي المتدرج. اضبط درجة حرارة أخرى على 4 درجات مئوية وسرعة دوران 859 × جم ، مع التباطؤ القياسي ، لخطوات الغسيل.

< p class = "jove_title" >2. حصاد القولون

1. قتل الفأر عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بطريقة تأكيدية معتمدة من AALAC.
2. ضع الفأر في وضع ضعيف ورش الفراء بنسبة 70٪ من الإيثانول. باستخدام مقص مناديل كبير ، قم بعمل شق عمودي في خط الوسط وكشف الصفاق السليم.
3. باستخدام مقص تشريح ناعم ، افتح الصفاق. استخدم الملقط لتحريك الأمعاء الدقيقة إلى جانب واحد وفضح القولون الهابط. اسحب قليلا لأعلى على القولون الهابط لكشف الجزء الشرجي من القولون إلى أقصى حد. اقطع المستقيم البعيد بعمق في الحوض وقم بتشريح وإزالة القولون بالكامل كوحدة واحدة ، من المستقيم البعيد إلى غطاء الأعرج.
4. انقل القولون في 20 مل من محلول القولون المبرد في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل.

< p class = "jove_title" >3. تنظيف القولون

1. ضع القولون على منشفة ورقية مبللة واستخرج البراز الصلب عن طريق الضغط الخفيف على جدار الأمعاء بنهاية حادة من المقص أو الملقط.
2. ضع القولون في طبق بتري واغسل القناة الهضمية ب 10 مل من محلول القولون المبرد باستخدام حقنة سعة 10 مل بإبرة تعبئة حادة 18 جرام.
3. انقل القولون إلى منشفة ورقية مبللة من Colon Buffer وقم بإزالة المساريق والدهون بنهاية المقص الحادة.
4. ضع القولون في طبق بتري مليء ب 5-10 مل من القولون المبرد مع التقليب يدويا لغسل محتويات القولون المتبقية. كرر 2-3 مرات.
5. اقطع القولون طوليا من نهايته الشرجية العضلية إلى القولون القريب (يولد قطعة واحدة مستطيلة مفتوحة من القولون) في طبق بتري مليء بمحلول القولون الطازج والمبرد. تخلص من الوسائط الموجودة وأعد تعبئتها باستخدام محلول القولون المبرد النظيف.
6. اغسل الأمعاء 3 مرات عن طريق تحريكها بقوة في طبق بتري واستبدال 5-10 مل من محلول القولون المبرد بعد كل غسلة.
7. ضع منديل القولون المستطيل على منشفة ورقية مبللة بمحلول القولون واقطعه عن طريق تقطيعه أفقيا ثم إلى أجزاء صغيرة (أقسام 3 مم × 3 مم).
8. اجمع شظايا القولون بعناية باستخدام ملقط دقيق في 20 مل من محلول القولون المبرد في أنبوب مخروطي بولي بروبيلين سعة 50 مل.
9. اغسل شظايا القولون ثلاث مرات ، كل غسلة في 20 مل من محلول القولون المؤقت ، عن طريق تحريك الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية. صب أو شفط الطافية بالتفريغ مع منع فقدان شظايا الأنسجة في عملية الشفط بين كل غسلة.
   ملاحظه: ليست هناك حاجة لتغيير الأنبوب بعد كل غسلة.

< ص الفئة = "jove_title" >4. هضم الكولاجيناز 1

1. أضف 20 مل من محلول هضم الكولاجيناز إلى شظايا القولون المغسولة في الأنبوب المخروطي البولي بروبلين سعة 50 مل.
2. ضع الأنبوب المغلق سعة 50 مل عند 37 درجة مئوية في شاكر مداري محتضن مع ضبط معدل الدوران على 2 × جم لمدة 60 دقيقة. تأكد من أن شظايا الأنسجة في حركة مستمرة أثناء التحريض ؛ إذا لزم الأمر ، قم بزيادة معدل الدوران بشكل تدريجي لضمان عدم استقرار شظايا الأنسجة في قاع الأنبوب.

5. تحضير تدرجات وسائط الفصل القائمة على السيليكا

1. قم بإعداد وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا بنسبة 66٪ و 44٪ ، باستخدام وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا بنسبة 100٪ عند 20 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) ومحلول القولون.
2. صب 5 مل من وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا بنسبة 66٪ في كل من 3 أنابيب منفصلة من البولي بروبيلين سعة 15 مل. تحضير ثلاثة أنابيب لكل نقطة. يشكل هذا القاعدة ذات الكثافة العالية لإجراء عزل التدرج ، حيث سيتم وضع وسائط فصل منخفضة الكثافة لإنشاء تدرج الفصل.
3. يحفظ في درجة حرارة 20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >6. مجموعة من المواد الطافية من الهضم 1

1. اجمع المادة الطافية فقط باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل وقم بتصفية المادة الطافية من خلال مصفاة خلية نسيجية مرشحة بحجم 40 ميكرومتر موضوعة في أنبوب مخروطي بولي بروبيلين نظيف سعة 50 مل، بعد اكتمال هضم الكولاجيناز 1. احرص على عدم شفط أي شظايا أنسجة موجودة.
   ملاحظة: احتفظ بأي شظايا أنسجة مرئية متبقية في الأنبوب. ستخضع هذه الهضم الثاني للكولاجيناز (الخطوة 8).

< p class = "jove_title" >7. تبريد عازلة هضم الكولاجيناز

1. املأ أنبوب البولي بروبلين سعة 50 مل بالكامل باستخدام Colon Buffer المبرد.
   ملاحظه: ينشط الكولاجيناز عند 37 درجة مئوية. ومن ثم فإن المخزن المؤقت المبرد يعطل هذا الإنزيم.
2. الطرد المركزي للأنبوب عند 4 درجات مئوية عند 800 × جم لمدة 5 دقائق.
   1. تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط بالفراغ. اغسل الخلايا ب 25 مل من محلول القولون الطازج وجهاز الطرد المركزي بوزن 800 × جم لمدة 5 دقائق.
   2. أعد تعليق الحبيبات في أقل من 1 مل من الطازجة, محلول القولون المبرد.
   3. ضع الأنبوب المخروطي البولي بروبلين سعة 50 مل على الثلج.

< ص الفئة = "jove_title" >8. هضم الكولاجيناز 2

1. كرر الخطوة 4 (الهضم 1) مع الاحتفاظ بشظايا الأنسجة المتبقية من الخطوة 6.1.

< p class = "jove_title" >9. تفكيك الأنسجة بعد الهضم 2

1. اغسل شظايا الأنسجة بقوة ذهابا وإيابا بين الأنبوب وحقنة سعة 10 مل من خلال إبرة غير حادة 18G.
2. كرر هذا التدفق لمدة لا تقل عن 7-8 ممرات كاملة ، واستمر حتى لا تظهر شظايا الأنسجة الإجمالية أو الحطام.

< p class = "jove_title" >10. تصفية الخلايا

1. قم بتمرير تعليق تفكيك الأنسجة من خلال مصفاة خلية نسيجية مرشحة مسام 40 ميكرومتر في أنبوب بولي بروبيلين نظيف سعة 50 مل.
2. اغسل مصفاة خلايا نسيج الترشيح باستخدام 10 مل من محلول القولون المبرد لاستعادة أي خلايا عالقة في الفلتر.

< ص الفئة = "jove_title" >11. تبريد هضم الكولاجيناز

1. املأ الأنبوب المخروطي البولي بروبلين سعة 50 مل بالحافة باستخدام Colon Buffer المبرد.
   ملاحظة: تعد درجة حرارة Colon Buffer أمرا بالغ الأهمية لضمان تبريد نشاط الكولاجيناز.
2. يدور عند 4 درجات مئوية و 800 × جم لمدة 5 دقائق.
3. تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط بالفراغ.
4. يغسل عن طريق التعليق في 25 مل من محلول القولون الطازج والمبرد ، متبوعا بالطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 800 × جم لمدة 5 دقائق.
5. تخلص من المادة الطافية عن طريق الشفط بالفراغ.
6. تجمع الحبيبات المعلقة من Collagenase Digest 1 (الخطوة 7) إلى الأنبوب المقابل لها من الخطوة 11.4.
7. كرر الخطوة 11.4 (الغسيل والطرد المركزي).

< p class = "jove_title" >12. فصل وسائط فصل الكثافة القائم على السيليكا

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات من 12 إلى 13 في أسرع وقت ممكن لضمان التبريد السريع لنشاط الكولاجيناز.

1. بعد الخطوة 11.7, أعد تعليق كل حبيبات في 24 مل إجمالي 44٪ وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا لكل نقطتين.
2. ضع ببطء 8 مل من الوسائط من الخطوة 12.1 على كل أنبوب من الأنابيب الثلاثة المحضرة في الخطوة 5.2 (تحتوي على 66٪ من وسائط فصل الكثافة القائمة على السيليكا)، باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. حافظ على تدفق ثابت وبطيء لوسائط فصل الكثافة بنسبة 44٪ أثناء وضع طبقات من التدرج لتجنب تعطيل الواجهة.
3. قم بموازنة جميع الأنابيب داخل جرافات الطرد المركزي بعناية باستخدام ميزان وزن أو ميزان.
4. قم بتدوير الأنابيب لمدة 20 دقيقة عند 859 × جم في جهاز طرد مركزي بدون فرامل عند 20 درجة مئوية. اسمح للدوارات بالراحة الكاملة قبل إزالة الأنابيب ، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا في واجهة التدرج.

13. اجمع الخلايا أحادية النواة من واجهة التدرج

1. تصور واجهة التدرج (بالقرب من علامة 5 مل) ، حيث يوجد عادة شريط أبيض بسمك 1-2 مم (يحتوي على MNC).
   ملاحظه: قد يرى المرء أو لا يرى شريطا أبيض. ومع ذلك ، ستكون MNC في هذه الواجهة ويجب أن تحجب وضوح واجهة التدرج.
2. قم بالشفط بالتفريغ والتخلص من أعلى 7 مل من التدرج العلوي للسماح بوصول الماصة بسهولة إلى الواجهة.
3. باستخدام الشفط اليدوي المستمر وحركة المعصم الدوارة الثابتة ، اجمع طبقة واجهة الخلايا في أنبوب مخروطي بولي بروبيلين نظيف سعة 50 مل. اجمع حتى تصبح الواجهة بين التدرجات واضحة وقابلة للانكسار (خالية من الخلايا).
4. املأ أنبوب التجميع ب 50 مل من FACS Buffer المبرد. تدور عند 4 درجات مئوية ، 800 × جم لمدة 5 دقائق.
5. قم بشفط المادة الطافية عن طريق الشفط بالفراغ وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من FACS Buffer.
6. عد الخلايا على مقياس كثافة الدم عند تخفيف 1: 2 باستخدام طرق استبعاد الخلايا الميتة المناسبة.
7. انتقل إلى تلطيخ FACS أو فحوصات أخرى باستخدام MNC القولون المعزول حديثا.

الجدول 1: جدول تحضير الحل

حل صيغة عازلة القولون 500 مل RPMI + 10 ملي HEPES + 10٪ FBS (معطل بالحرارة عند 56^درجةمئوية لمدة 60 دقيقة، وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.3) وسائط تدرج الكثافة القائمة على السيليكا 100٪ (لكل نقطتين) 22.5 مل من وسائط التدرج الكثافة القائمة على السيليكا + 2.5 مل من 10x PBS. وسائط تدرج الكثافة القائمة على السيليكا 66٪ (لكل نقطتين) 10.72 مل وسائط تدرج الكثافة القائمة على السيليكا 100٪ + 5.28 مل عازلة القولون وسائط تدرج الكثافة القائمة على السيليكا 44٪ (لكل نقطتين) 11 مل وسائط تدرج الكثافة القائمة على السيليكا 100٪ + 14 مل عازلة القولون عازلة هضم الكولاجيناز (لكل قولون) 100 وحدة / مل من الكولاجيناز E من المطثية النسيجية ، مذاب في 40 مل من محلول القولون FACS المخزن المؤقت 500 مل 1x PBS + 5 جم BSA + 1 مم EDTA + 0.2 جم أزيد الصوديوم

المواد