عزل الغدد القاعية المعدية: طريقة لعزل الغدد القاعية من أنسجة المعدة البشرية

الملخص

المصدر: Teal، E. et al. ثقافة أحادية الطبقة الظهارية المعدة الأولية المشتقة من الفئران والإنسان لدراسة التجديد. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو طريقة لعزل الخلايا الظهارية في المعدة من أنسجة قاع الرحم. يمكن استخدام الخلايا الظهارية المعزولة كنموذج في المختبر لدراسة أدوارها التنظيمية في فسيولوجيا المعدة والفيزيولوجيا المرضية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان وتم استعراضها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. إنشاء عضيات قاع المعدة ثلاثية الأبعاد المشتقة من الإنسان

ملاحظة: لتجنب التلوث ، قم بإجراء البروتوكول بالكامل داخل غطاء مزرعة الأنسجة المعقمة. تم جمع أنسجة قاع الرحم البشرية من المرضى الذين يخضعون لعملية تكميم المعدة.

1. اجمع الأنسجة من المرضى الذين يخضعون لعملية تكميم المعدة وضعها في محلول ملحي ذو فوسفات مخلة (DPBS) من Dulbecco الخالية من الكالسيوم^المثلج في وعاء بلاستيكي كبير.
2. باستخدام الملقط ، اغسل الأنسجة بقوة في دورق معقم يحتوي على 100 مل من Ca^{2 +}/Mg²⁺ خالية من DPBS. يغسل لمدة 30 ثانية تقريبا أو حتى تتم إزالة الحطام والدم. بعد ذلك ، باستخدام شاش معقم ، امسح الطبقة المخاطية من الظهارة.
3. باستخدام ملقط كبير ، أمسك بقوة الطبقة العضلية من الأنسجة ، وبقوة ، اكشط الظهارة باستخدام ملقط مرقئ منحني كبير. اجمع الأجزاء الظهارية المكشطة في طبق بتري معقم من البوليسترين.
4. افرم الأنسجة الظهارية إلى شظايا بحجم 2.0 × 2.0 مم^{تقريبا باستخدام} شفرات الحلاقة لتحسين هضم الأنسجة. اغسل شظايا الأنسجة ب 2^+/ملغ 2+ خال من القنوات الحيوية (Ca²⁺/Mg²⁺ -خال من DPBS، 1٪ بنسلين/ستربتومايسين، 0.25 ملغم/مل أمفوتريسين ب/10 ملغ/مل جنتاميسين، 50 ملغم/مل كاناميسين)، حتى يخلو الغسيل من الدم. قم بإجراء غسلات متعددة إذا لزم الأمر. تخلص من الغسيل عن طريق تصفية الغسيل بعناية من خلال شاش معقم في دورق نفايات.
5. اجمع الأجزاء المغسولة في قارورة زجاجية مستديرة القاع سعة 125 مل مع قضيب تقليب 25 مم ووسائط حضانة مسخنة مسبقا (الوسائط القاعدية المكملة ب 2 ملي مولار من الجلوتامين ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 10 ملي مولار HEPES Buffer ، 1 مجم / مل من النوع 1 من الكولاجيناز من النوع 1 ، 2 مجم / مل ألبومين مصل الأبقار من فئة زراعة الخلايا). أغلق القارورة السفلية المستديرة بحاجز مطاطي.
6. أدخل إبرة شوكية 20G في الحاجز وقم بتوصيلها بخزان أكسجين باستخدام خراطيم مطاطي. لتصفية أي ملوثات ، أدخل المناديل الورقية في الأنبوب لإنشاء مرشح. قم بتشغيل تدفق الأكسجين على مستوى منخفض. أدخل 10-15 إبرة تدفق في الحاجز لتجنب تمزق الحاجز.
7. قم بتثبيت الإعداد على حامل حلقي باستخدام المشابك وضعه في حمام مائي معاير إلى 37 درجة مئوية مع لوح تقليب لمدة 30-45 دقيقة. بعد احتضان الأنسجة لمدة 15 دقيقة ، قم بإزالة 50 ميكرولتر من وسائط الحضانة وتحقق بصريا من الغدد المنفصلة. إذا لم تكن الغدد كثيفة أو لم تنفصل عن الأنسجة ، اتركيها لمدة 5-10 دقائق إضافية.
8. بعد الحضانة مباشرة، أضف 50 مل من DMEM/F-12 المسخن مسبقا إلى وسائط الحضانة باستخدام ماصة مصلية معقمة أو عن طريق سكبها مباشرة في خليط الحضانة.
9. قم بتصفية خليط الغدة من خلال شاش معقم إلى أربعة أنابيب مخروطية سعة 50 مل. احتفظ بالمرشح على الجليد لمدة 15 دقيقة للسماح للغدد المستخرجة بالاستقرار في قاع الأنبوب المخروطي. احرص على عدم إزعاج الغدد المستقرة. قم بإزالة أعلى 40 مل من المادة الطافية والتخلص منها باستخدام ماصة مصلية. أعد تعليق ال 10 مل المتبقية في 10 مل من DPBS المكملة بالمضادات الحيوية.
10. وزعي الخليط بالتساوي في أنابيب اختبار زراعة الخلايا سعة 5 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 65 × جم عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
    ملاحظه: من الأهمية بمكان تنفيذ هذه الخطوة على الجليد وتجنب بلمرة مصفوفة الغشاء القاعدي أثناء الخلط. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم فحص كثافة الغدة بصريا عن طريق أخذ عينات ل 50 ميكرولتر. الكثافة المثلى هي ~ 70٪ التقاء.
11. بعد ذلك ، ضع الغدد في 50 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام ماصة عريضة الرؤوس. تجنب إنتاج أي فقاعات أثناء الطلاء.
12. للسماح لمصفوفة الغشاء القاعدي بالبلمرة ، احتضن لمدة 10 إلى 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في حالة الطلاء في صفيحة استزراع 12 بئرا ، أضف 1 مل من وسائط hFGO (وسط النسر المعدل من Advanced Dulbecco / وسط F-12 المكمل ب 2 ملي من L-glutamine ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 0.25 مجم / مل أمفوتريسين B / 10 مجم / مل جنتاميسين ، 50 مجم / مل كاناميسين ، 10 ملي مولار عازلة هيبس ، 1 ملي ن-أكتيل سيستين ، 1 × N2 ، 1 × B27 ، 50٪ وسط مكيف Wnt ، 20٪ وسط مكيف R-spondin مكمل بمثبط بروتين مورفوجيني للعظام 100 نانوغرام / مل ، 1 نانومتر غاسترين ، 50 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة ، 200 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية 10 ، 10 ملي نيكوتيناميد ، و 10 ميكرومتر Y-27632 مثبط ROCK) لكل بئر. إذا لم تستخدم لوحة ثقافة مكونة من 12 بئرا ، فأضف وسائط كافية لغمر فقاعة مصفوفة الغشاء القاعدي.
13. استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا المرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. قم بتغيير الوسائط كل 4-5 أيام.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Ca2 + / Mg2 + خالية من DPBS صياد 21-031س.ف شاش معقم ملقط مرقئ منحني طبق بتري معقم شفرات حلاقة معقمة وسط النسر المعدل / F12 المتقدم من Dulbecco (الوسائط القاعدية) تقنيات الحياة هاتف: 12634-010 البنسلين / الستربتومايسين الترمو: العلمية SV30010 الأمفوتريسين ب / الجنتاميسين الترمو: العلمية R01510 جلوتاماكس (L-جلوتامين) تقنيات الحياة هاتف: 25030-081 كاناميسين ثيرمو فيشر ريال عماني 1510 الكولاجيناز النوع 1 ورثينجتون LS004214 ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش أ 9418 عازلة HEPES سيجما ألدريتش H0887 125 مل قارورة قاع مستديرة 1 بوصة (25 مم) شريط تحريك الحاجز المطاطي 20 جرام إبر شوكية بطول 3.5 ثيرمو فيشر 405182 Kimwipes (المناديل الورقية) فيشر العلمية 06-666 ج خزان الأكسجين مع خراطيم مطاطي المشابك الدائري 37 درجة مئوية حمام مائي 5 مل أنابيب اختبار زراعة الخلايا صياد 14-956-3 ج