$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير الآلات ووسائط الثقافة والأطباق
- الأوتوكلاف مجموعة واحدة من المقصات المعوية والمقص العادي والملقط في وعاء معقم.
- ضع طبقا بسعة 96 بئرا (قاع مسطح) في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
- قم بإعداد 10 مل من وسط الاستزراع الكامل باستخدام الكواشف المدرجة في جدول المواد.
- احتضان الوسط الكامل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- قم بإذابة الغشاء القاعدي المعاد تشكيله عن طريق وضعه في دلو ثلج. سيصبح الغشاء القاعدي المعاد تشكيله سائلا عند 4 درجات مئوية.
- املأ أربعة أطباق بتري بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات أو PBS (4 درجات مئوية).
2. عزل الخبايا المعوية الدقيقة
- التضحية باستنشاق ثاني أكسيد الكربون2 ماوس Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 على خلفية C57BL6 / J. تشريح الصفاق طوليا باستخدام مقص.
- امسك المعدة بالملقط واقطعها عرضيا إلى نصفين.
- باستخدام مقص الأمعاء من الآن فصاعدا ، اسحب الأمعاء وضعها في طبق بتري يحتوي على PBS.
ملاحظه: مقص الأمعاء له طرف حاد وحاد. يهدف الطرف الحاد لهذا المقص إلى عدم إتلاف بنية الزغابات أثناء فتح الأمعاء.
- ابدأ بوضع الطرف الحاد في المعدة وادفعه برفق عبر البواب. استمر في القطع بالمقص والسحب بالملقط.
- بمجرد فتح الأمعاء الدقيقة بالكامل طوليا ، اغسلها في PBS البارد عن طريق إمساكها بالملقط واشطفها برفق في محلول PBS بحركات على شكل حرف U.
- بمجرد إزالة جميع بقايا البراز ، انتقل إلى تسطيح الأمعاء على لوح تقطيع ، بحيث يكون الجانب اللمعي لأعلى. يمكن التعرف بسهولة على الجانب اللمعي من خلال عدم وجود الأوعية الدموية ومظهره الباهت عند مقارنته بالجزء الخارجي.
- باستخدام شريحة زجاجية ، قم بإزالة الزغابات برفق عن طريق كشط الأمعاء المسطحة. قم بتنفيذ هذه الخطوة مرتين على طول الأنسجة بالكامل.
- قطع الأمعاء الدقيقة بشفرة جراحية معقمة إلى قطع 2-5 مم.
- ضع شظايا الأمعاء الدقيقة في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من PBS المثلج.
- نظف شظايا الأنسجة ، وقم بإزالة أي شوائب متبقية عن طريق ماصتها لأعلى ولأسفل في PBS. تخلص من المادة الطافية وكرر هذه الخطوة حتى يصبح PBS واضحا تماما.
- أضف 15 مل من PBS البارد ليصل الحجم النهائي الإجمالي ل PBS إلى 25 مل. أضف 2 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) واحتضنه لمدة 45 دقيقة على أسطوانة عند 4 درجات مئوية.
- تجاهل PBS / EDTA.
- أضف 10 مل من PBS وافصل الخبايا عن طريق سحب شظايا الأنسجة بقسوة لأعلى ولأسفل (ثلاث مرات على الأقل). اجمع المادة الطافية.
- كرر الخطوة 2.13 أربع مرات. أضف وسط الثقافة للوصول إلى الحجم النهائي 50 مل.
- بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي (300 × جم لمدة 5 دقائق).
- أعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط الاستزراع وحبيبات الخبايا عن طريق الطرد المركزي (80 × جم لمدة 3 دقائق).