تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. عزل المستعمرات النقيلية
- في اليوم 5 بعد الحقن ، قم بإزالة الأجنة من الحاضنة وفحص CAMs للجنين بحثا عن توزيع المستعمرة النقيلية. حدد الأجنة ذات التوزيع المستعمري المنتظم التي توجد فيها ><مستعمرات مدمجة (أو مفرطة التوغل).
ملاحظه: عملية زراعة أجنة الدجاج ليست معقمة ، لذلك يجب تنفيذ جميع خطوات الفحص في ظل ظروف نظيفة للغاية لتجنب تلوث زراعة الأنسجة في المستقبل. التلوث نادر جدا ويمكن تجنبه بسهولة عن طريق ارتداء القفازات والقناع واستخدام أدوات معقمة فقط أثناء حقن الخلايا وإجراءات عزل المستعمرة. يوصى بفحص الأجنة واحدة تلو الأخرى لتقليل تعرضها لدرجة حرارة المختبر المحيطة ومنع التلوث.
- حدد موقع المستعمرة النقيلية ذات الأهمية. يمكن وصف المستعمرة المدمجة بأنها مستعمرة بها معظم الخلايا السرطانية الموجودة داخل منطقة محدودة في أنسجة الطب التكميلي والبديل (تظهر الخلايا "متجمعة معا"). يمكن وصف المستعمرة الغازية بأنها مستعمرة حيث "تناثر" الخلايا السرطانية في أنسجة الطب التكسير البديل (الشكل 1 أ ، ب).
ملاحظة: يمكن تفسير "انضغاط" المستعمرة النقيلية إما عن طريق تثبيط غزو الخلايا السرطانية أو تثبيط تكاثر الخلايا السرطانية أو كليهما. يجب الانتباه إلى جميع السيناريوهات ، ويجب عزل مستعمرات الاتصال (الشكل 1 أ ، ب). يمكن استخدام مجهر مجسم فلوري بسيط للتمييز بين الأنماط الظاهرية للمستعمرة النقيلية المدمجة والغازية.
- تحت مجهر التشريح ، اسحب أنسجة CAM التي تحتوي على المستعمرة النقيلية ذات الأهمية برفق لأعلى باستخدام ملقط دقيق (الشكل 1 ج).
- قطع أنسجة الطب التكميلي والبديل التي تحتوي على المستعمرة النقيلية باستخدام المقص الجراحي.
- انقل أنسجة الطب التكميلي والبديل التي تحتوي على المستعمرة النقيلية إلى أنبوب فارغ ومعقم سعة 1.5 مل (على الثلج) وأغلق غطاء الأنبوب.
ملاحظه: يمكن الاحتفاظ بالمستعمرات المعزولة على الجليد لمدة تصل إلى 3 ساعات دون فقدان الجدوى.
- كرر إجراء الاستئصال حتى يتم جمع جميع المستعمرات ذات الأهمية في أنابيب منفصلة. لتجنب معاناة ، لا تستأصل أكثر من 2-3 مستعمرات من جنين واحد. القتل الرحيم للأجنة عن طريق التجميد عند -20 درجة مئوية (أو طريقة أخرى معتمدة) مباشرة بعد استئصال المستعمرة.
- قم بفرم أنسجة CAM برفق في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام إبرة معقمة 18G. استخدم إبرة منفصلة لكل مستعمرة.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول الكولاجيناز 1x واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- قم بتدوير الخلايا وأنسجة CAM عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة الحرارة المحيطة.
- شفط محلول الكولاجيناز وأعد تعليق الخلايا في وسائط كاملة تستخدم لخط الخلية المعنية.
ملاحظه: عادة ، لا يتم فصل أنسجة الطب التكميلي والبديل تماما بعد علاج الكولاجيناز ، وسوف تتكاثر الخلايا السرطانية أولا داخل قطع أنسجة الطب التكميلي والبديل وتهاجر لاحقا فقط إلى طبق زراعة الأنسجة.
- قم بتدوير الخلايا وأنسجة CAM مرة أخرى عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة الحرارة المحيطة.
- أعد تعليق الخلايا وقطع أنسجة CAM في 1 مل من الوسائط الكاملة بالإضافة إلى عامل الاختيار (إن وجد) ، ثم انقلها إلى طبق واحد لزراعة الأنسجة 12 بئر جيدا.
ملاحظه: قد تستمر الخلايا الليفية CAM للدجاج في زراعة الأنسجة لممرات متعددة تمنع التوسع النسيلي. القدرة على توسيع المستعمرات النقيلية في وجود عامل اختيار (على سبيل المثال ، إذا كان الناقل الذي تم استخدامه لجعل الخلايا السرطانية فلورية يشفر أيضا جين مقاومة المضادات الحيوية للثدييات) قد يسرع بشكل كبير من التوسع النسيلي. يجب إجراء تجربة منحنى القتل قبل الفحص لضمان استخدام التركيز المناسب للمضادات الحيوية.
- خلال الأسابيع 1-3 القادمة ، راقب الخلايا السرطانية يوميا بحثا عن النمو والتلوث.
- عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ من التقاء ، انقل الخلايا إلى طبق ثقافة أكبر حجما.
ملاحظه: يوصى بتوسيع الخلايا حتى يمكن تجميد قارورتين مبردتين على الأقل من كل استنساخ. يمكن أن يكون الحفاظ على كميات كبيرة من زراعة الأنسجة شاقا وغير ضروري.
- انتقل إلى التسلسل أو الجولة التالية من الاختيار بمجرد الوصول إلى عدد كاف من الخلايا السرطانية. بشكل عام ، 1 × 106 من الخلايا السرطانية كافية لتقنيات التسلسل الحديثة عالية الإنتاجية.
- انتقل إلى إعادة حقن الاستنساخ والتصوير والقياس الكمي لضغط المستعمرة أو ملامسة الخلايا السرطانية للأوعية الدموية (الشكل 2 أ). بدلا من ذلك ، انتقل إلى تسلسل الإنتاجية العالية أو كرر اختيار المستعمرة.
ملاحظة: لتقليل عدد الإيجابيات الخاطئة ، يوصى بجولتين على الأقل من الاختيار. وقد استخدم نهجان بنجاح. 1) قم بتوسيع كل استنساخ وأعد حقنه بشكل فردي لتأكيد النمط الظاهري للمستعمرة. 2) امزج جميع المستنسخة الموسعة بنسبة 1: 1 لكل منها ، وأعد حقنها كخليط ، وكرر دورة الاختيار.
