عزل واستزراع الخلايا الظهارية لسان الفئران: إجراء لعزل وزراعة الخلايا الظهارية للسان من نموذج الفأر

الملخص

المصدر: براساد، م. وآخرون. في المختبر لإنشاء خط خلية سرطان رأس وعنق الفئران المعدلة وراثيا باستخدام نظام فيروس Cas9 المرتبط بالغدة. J. Vis. Exp. (2020)

< p class = "jove_content">في هذا الفيديو ، نصف عزل الخلايا الظهارية عن لسان الفئران. يمكن استزراع هذه الخلايا بشكل أكبر لتكوين مستعمرات الخلايا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. عزل وثقافة الخلايا الأولية

1. القتل الرحيم لذكر أو أنثى B6 يبلغ من العمر 6 أسابيع ؛ 129-GT (ROSA) 26Sortm1 (CAG-cas9 * ، -EGFP) Fezh / J عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون أو أي بروتوكول آخر معتمد من IACUC.
   ملاحظه: تحتوي هذه الفئران CRISPR / Cas9 knockin على تعبير Cre المعتمد على إعادة الإدماجية عن نوكلياز cas9 و EGFP بتوجيه من محفز CAG. يمنع تسلسل Lox-Stop-Lox (LSL) الموجود في جينوم هذه الفئران التعبير عن Cas9 و EGFP في حالة عدم وجود Cre recombinase. عند استخدامها مع الحمض النووي الريبي المرجعي الفردي (sgRNAs) ومصدر Cre ، فإنها تسمح بتحرير جينات الفأر المفردة أو المتعددة في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي.
2. قم بتشريح اللسان من الفئران التي تم قتلها الرحيم باستخدام مقص جراحي.
3. قم بفصل الأنسجة يدويا عن طريق فرم أنسجة اللسان إلى أجزاء صغيرة جدا باستخدام مشرط. اجمع شظايا الأنسجة في أنبوب سعة 15 مل يحتوي على 4.5 مل من وسط RPMI العادي (بدون مصل).
4. أضف مزيج الإنزيم الثلاثي (200 ميكرولتر) (انظر الجدول 1 للوصفة) إلى شظايا الأنسجة.
5. احتضان مزيج الأنسجة والإنزيم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة واضغط على الأنبوب كل 10 دقائق لتعزيز التفكك الأنزيمي للأنسجة.
6. أضف 5٪ مصل بقري الجنين (FBS) الذي يحتوي على HBSS / PBS إلى مزيج إنزيم الأنسجة لإيقاف عمل الإنزيم.
7. قم بتصفية معلق الخلية أعلاه من خلال شبكة نايلون معقمة 70 ميكرومتر لفصل الخلايا المشتتة وشظايا الأنسجة الأكبر.
8. اغسل تعليق الخلية المفلترة عن طريق الطرد المركزي لمدة 300 × جم لمدة 5 دقائق في HBSS / PBS في RT.
9. أعد تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع (10٪ FBS في RPMI / DMEM) وتنمو في أطباق استزراع 60 مم حتى تتشكل مستعمرات خلايا متميزة.
   1. يتم الاحتفاظ بمجاميع الخلايا المزروعة أعلى المرشح في طبق استزراع 60 مم يحتوي على 3 مل من الوسائط الكاملة (10٪ FBS في RPMI / DMEM) حتى يتم تكوين مستعمرات الخلايا.
10. فحص الخلايا الأولية مجهريا بحثا عن تلوث الخلايا الليفية بعد أسبوع واحد من الزراعة. عالج الخلايا الأولية المطورة من الركام ومعلقات الخلايا بمحلول 0.25 تريبسين 0.02٪ EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة لإزالة الخلايا الليفية.
    ملاحظه: عادة ما تنتج الثقافة الأولية من مجاميع الخلايا المزيد من المستعمرات مقارنة بالمعلقات أحادية الخلية. توفر الخلايا من هذه المستعمرات كفاءة نقل أفضل مع نقل AAV.

10X حل مخزون الإنزيم الثلاثي: كولاجيناز 1 جم كونك نهائي [10 مجم / مل] الهيالورونيداز 100 مجم [1 ملغم/مل] DNase 20,000 وحدة التركيب النهائي [200 مجم / مل] برنامج تلفزيوني 1X اصنع ما يصل إلى 100 مل

الجدول 1: وصفة المخزن المؤقت المستخدم في هذه الدراسة

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات سلالات الفأر C57BL / 6 إنفيجو ب 6 ؛ 129-GT (ROSA) 26Sortm1 (CAGcas9 * ، -EGFP) Fezh / J مختبرات جاكسون هاتف: 24857 موافقه. CB17-Prkdc-scid / NCr Hsd (Nod.Scid) إنفيجو الانزيمات بنزوناز سيغما E1014 كولاجيناز الرابع ثيرمو فيشر العلمي 17104019 الحمض النووي ثيرمو فيشر العلمي 18047019 الهيالورونيداز MilliporeSigma H3506 التربسين الصناعات البيولوجية إسرائيل بيت هيمك المحدودة 03-050-1 ب وسائط الاستزراع والمواد الكيميائية والكواشف جيش صرب البوسنه أمريسكو 0332-تام-50 جم DMEM الصناعات البيولوجية إسرائيل بيت هيمك المحدودة 01-055-1 أ FBS الصناعات البيولوجية إسرائيل بيت هيمك المحدودة 04-127-1 أ HBSS سيغما H6648 برنامج تلفزيوني الصناعات البيولوجية إسرائيل بيت هيمك المحدودة 02-023-1 أ عازلة تريس ميرك ميليبور 648311-1 كجم الأواني البلاستيكية فلتر أميكون الترا 100 دالتون ميليبور UFC910024 مرشحات معقمة 0.22 ميكرومتر ، 4 مم ميليكس SLGV004SL مرشحات معقمة 0.45 ميكرومتر ، 13 مم ميليكس SLHV013SL لوحات الثقافة غرينر بيو ون أنابيب الصقر غرينر بيو ون