المعالجة المسبقة للأنسجة FFPE ل RNA CISH: إجراء لمعالجة أقسام الأنسجة المضمنة في البارافين الثابتة بالفورمالين للتهجين الموضعي للحمض النووي الريبي الكروموجيني في الموقع

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Outh-Gauer ، S. et al. التهجين الموضعي الكروموجينيك كأداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو الخطوات المتبعة في المعالجة المسبقة لعينات أنسجة FFPE لتهجين الحمض النووي الريبي الكروموجيني في الموقع. تساعد عملية المعالجة المسبقة في الحفاظ على سلامة الحمض النووي داخل الخلايا ومورفولوجيا الأنسجة بشكل عام.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان وتم استعراضها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

1. تحضير كاشف استرجاع الهدف 1x
   1. في دورق كبير ، أضف 70 مل من كاشف الاسترجاع المستهدف 10x (انظر جدول المواد) إلى 630 مل من الماء المقطر.
   2. ضع الدورق على لوح تسخين باستخدام محرك مغناطيسي. قم بتغطيته بورق الألمنيوم.
   3. اغلي محتوياته على حرارة 100 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة < / > ملاحظة: لا تدعها تغلي لأكثر من 30 دقيقة.

< p class = "jove_title" >2. المعالجة المسبقة للأنسجة

ملاحظة: تتبع هذه الخطوات توصية المعالجة المسبقة "القياسية" وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لعينات الرأس والرقبة. قد يلزم تعديل توقيت القسمين 2.1 و 2.2 اعتمادا على الأنسجة التي تم التلاعب بها.

1. حصار نشاط البيروكسيديز
   1. أضف 4-6 قطرات من بيروكسيد الهيدروجين (انظر جدول المواد) إلى كل شريحة واحتضنها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   2. اغسل الشرائح 2x لمدة دقيقتين في ماء مقطر في درجة حرارة الغرفة.
2. كسر الحمض النووي الريبي / حدود الأنسجة
   1. باستخدام مخلب ، قم بإزالة رقائق الألومنيوم من كاشف استرجاع الهدف المغلي 1x (TTR1x) الموضوعة على لوحة تسخين وتوقف عن التقليب. اغمر رف الشرائح ببطء وحذر شديد لمدة 15 دقيقة. غطي الدورق مرة أخرى بورق الألمنيوم.
      ملاحظه: يجب أن يستمر الغليان خلال هذه الخطوة.
      أنذر: استخدم المخلب لمعالجة رقائق الألومنيوم ورف الانزلاق لتجنب إصابات الحروق. تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، مثل القفازات ومعطف المختبر.
   2. باستخدام المخلب ، انقل رف الانزلاق الساخن على الفور إلى حمام مائي مقطر واغسله لمدة 2 دقيقة < br / > ملاحظه: تأكد من أن العينات لا تبرد في TTR1x.
   3. اغسل الشرائح بالإيثانول الطازج بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين.
   4. دع الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
3. إنشاء الحاجز
   1. باستخدام قلم حاجز كاره للماء (انظر جدول المواد) ، ارسم حاجزا حول العينة. اتركه يجف لمدة 5 دقائق على الأقل < br / > ملاحظه: دع الحاجز يجف حقا. إذا كان يتآكل أثناء العملية ، فلا تتردد في رسمه مرة أخرى. تجنب لمس المنديل بالقلم. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا بين عشية وضحاها هنا.
4. هضم البروتياز
   1. ضع الشرائح على رف الشرائح وأضف ~ 4 قطرات من Protease Plus لكل عينة (انظر جدول المواد).
   2. قم بتغطية صينية التحكم في الرطوبة بغطاء وأدخلها في فرن التهجين لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية
      ملاحظه: لمنع التبخر ، تأكد من أن مقبض الدوران متحول بالكامل إلى وضع القفل.
   3. أخرجي الصينية من الفرن وأزيلي رف الانزلاق.
   4. شريحة واحدة في كل مرة ، قم بإزالة أي سائل زائد بسرعة وضع الشريحة في رف منزلق مغمور في طبق تلطيخ مملوء بالماء المقطر.
   5. اغسل الشرائح 2x لمدة دقيقتين في ماء مقطر في درجة حرارة الغرفة. تحريض باستمرار.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فرن HybEZ (110 فولت) شركة تشخيص الخلايا المتقدمة هاتف: 321710 رف منزلق HybEZ شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 300104 ImmEdge قلم حاجز مسعور شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 310018 RNAscope H202 وكاشف البروتياز الإضافي شركة تشخيص الخلايا المتقدمة هاتف: 322330 بيروكسيد الهيدروجين x2 والبروتياز زائد × 1 كواشف استرجاع هدف RNAscope شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 322000