تهجين المسبار وتضخيم الإشارة في تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع: تقنية للكشف عن تسلسلات الحمض النووي الريبي المحددة في أقسام الأنسجة

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Outh-Gauer ، S. et al. التهجين الموضعي الكروموجينيك كأداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو استراتيجية تهجين متسلسلة تتضمن تهجين مجسات mRNA إلى mRNA مستهدف محدد. بعد تهجين المسبار ، يتم إجراء تضخيم الإشارة لتحسين الدقة عن طريق تقليل نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء RNA-CISH للعينات النسيجية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاه الإنسان وتم استعراضها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

1. تشغيل الفحص

ملاحظة: لا تدع الأقسام تجف بين خطوات الحضانة.

1. تهجين مسبار فيروس الورم الحليمي البشري
   ملاحظة: تأكد من تسخين المجسات مسبقا لإذابة أي هطول الأمطار قبل الاستخدام. في هذه الخطوة ، بدلا من مسبار فيروس الورم الحليمي البشري ، يمكن أيضا استخدام بيبتيديل-بروليل إيزوميراز ب (PPIB) للتحكم الإيجابي أو اختزال ثنائي هيدروثنائي بيكولينات (DAPB) للتحكم السلبي (انظر جدول المواد).
   1. اضغط و / أو قم بالنقر فوق الشرائح لإزالة أي سائل زائد ووضعها في رف الشرائح. أضف ~ 4 قطرات من مسبار فيروس الورم الحليمي البشري لتغطية كل قسم بالكامل.
   2. غطي الصينية بغطاء وأدخليها في الفرن لمدة ساعتين عند 40 درجة مئوية.
      ملاحظة: لمنع التبخر ، تأكد من أن مقبض الدوران قد تم تدويره بالكامل إلى وضع القفل.
   3. أخرجي الصينية من الفرن وأزيلي رف الانزلاق.
   4. شريحة واحدة في كل مرة ، قم بإزالة أي سائل زائد بسرعة وضع الشريحة في رف منزلق مغمور في طبق تلطيخ مملوء بمخزن غسيل 1x.
   5. اغسل الشرائح في مخزن مؤقت للغسيل 1x لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مع تحريك مستمر. كرر هذا مع مخزن غسيل طازج 1x.
2. تهجين AMP1 و AMP2 و AMP3 و AMP4
   ملاحظة: تتضمن هذه الخطوات التهجين في فرن التهجين و AMP1–AMP4 من المجموعة المشتراة (انظر جدول المواد).
   1. اضغط و / أو قم بالتمرير السريع لإزالة أي سائل زائد من الشرائح ووضعها في رف الشرائح. أضف ~ 4 قطرات من AMP1 لتغطية كل قسم بالكامل.
   2. غطي الصينية بغطاء وأدخليها في الفرن لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية.
   3. أخرجي الصينية من الفرن وأزيلي رف الانزلاق.
   4. شريحة واحدة في كل مرة ، قم بإزالة أي سائل زائد بسرعة وضع الشريحة في رف منزلق مغمور في طبق تلطيخ مملوء بمخزن غسيل 1x.
   5. اغسل الشرائح في مخزن مؤقت للغسيل 1x لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مع تحريك مستمر. كرر هذا مع مخزن غسيل طازج 1x.
   6. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.5 ، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP2 بدلا من AMP1 واحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. اغسل الشرائح 2x لمدة دقيقتين ، في المرتين في مخزن مؤقت للغسيل الطازج.
   7. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.5 ، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP3 بدلا من AMP1 واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. اغسل الشرائح 2x لمدة دقيقتين ، في المرتين في مخزن مؤقت للغسيل الطازج.
   8. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.5 ، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP4 بدلا من AMP1 واحتضنها لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. اغسل الشرائح 2x لمدة دقيقتين ، في المرتين في مخزن مؤقت للغسيل الطازج.
3. تهجين AMP5 و AMP6
   ملاحظة: لا تشمل هذه الخطوات التهجين في الفرن ولكن التهجين في درجة حرارة الغرفة. يأتي AMP5 وAMP6 من المجموعة المشتراة (انظر جدول المواد).
   1. اضغط و / أو قم بالنقر فوق الشرائح لإزالة أي سائل زائد ووضعها في رف الشرائح. أضف ~ 4 قطرات من AMP5 لتغطية كل قسم بالكامل.
   2. غطي الصينية بغطاء واحتضنها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   3. شريحة واحدة في كل مرة ، قم بإزالة أي سائل زائد بسرعة وضعه في رف منزلق مغمور في طبق تلطيخ مملوء بمخزن غسيل 1x.
   4. اغسل الشرائح في مخزن مؤقت للغسيل 1x لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة مع تحريك مستمر. كرر هذا مع مخزن غسيل طازج 1x.
   5. كرر الخطوات 1.3.1-1.3.4 ، ولكن استخدم ~ 4 قطرات من AMP6 بدلا من AMP5 واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح 2x لمدة دقيقتين ، في المرتين في مخزن مؤقت للغسيل الطازج.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات فرن HybEZ (110 فولت) شركة تشخيص الخلايا المتقدمة هاتف: 321710 رف منزلق HybEZ شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 300104 RNAscope 2.5 كواشف الكشف عالي الدقة - براون شركة تشخيص الخلايا المتقدمة هاتف: 322310 تتضمن هذه المجموعة كواشف التضخيم AMP1 و AMP2 و AMP3 و AMP4 و AMP5 و AMP6 وكواشف الكشف DAB-A و DAB-B مسبار التحكم السلبي RNAscope 3-Plex شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 320871 DAPB مسبار التحكم الإيجابي RNAscope 3-Plex شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 320861 PPIB مسبار RNAscope - HPV16 / 18 شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 311121 RNAscope كواشف الغسيل العازلة شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 310091 عازلة الغسيل 50X x4