اكتشاف إشارة الحمض النووي الريبي CISH: تقنية للكشف عن الإشارات الكروموجينيكية أثناء تهجين الحمض النووي الريبي في الموقع في عينات الأنسجة السليمة

الملخص

المصدر: Outh-Gauer ، S. et al. التهجين الموضعي الكروموجينيك كأداة لتشخيص سرطان الرأس والرقبة المرتبط بفيروس الورم الحليمي البشري. J. Vis. Exp. (2019)

يقدم هذا الفيديو بروتوكول الكشف عن الإشارة أثناء تهجين الحمض النووي الريبي الكروموجيني في الموقع. يمكن استخدام هذه التقنية لتشخيص عدوى الأورام النشطة بصريا في عينة الأنسجة السليمة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف المضادة للتلطيخ

1. تحضير 50٪ هيماتوكسيلين.
   1. في غطاء الدخان ، أضف 100 مل من هيماتوكسيلين جيل الأول (انظر جدول المواد) إلى 100 مل من الماء المقطر في طبق تلطيخ.
      ملاحظه: يمكن إعادة استخدام محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 50٪ لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. تحضير 0.02٪ (وزن / حجم) ماء الأمونيا (كاشف أزرق).
3. في غطاء الدخان ، أضف 1.43 مل من هيدروكسيد الأمونيوم 1 نيوتن إلى 250 مل من الماء المقطر في أسطوانة متدرجة أو حاوية أخرى. ختم الاسطوانة بغشاء البارافين. امزج محتوياته جيدا لمدة 3x-5x.
   ملاحظه: لقياس كمية الفحص ، من الأهمية بمكان استخدام هيدروكسيد الأمونيوم. يمكن تحضير الكواشف في وقت مبكر. تأكد من بقاء جميع الحاويات مغطاة.

< p class = "jove_title" >2. كشف الإشارة باستخدام 3،3'-diaminobenzidine

< p class = "jove_content" >تنبيه: ديامينوبنزيدين (DAB) سام. اتبع الاحتياطات المناسبة وإرشادات السلامة عند التخلص من هذه المادة الكيميائية والتعامل معها.

1. امزج كميات متساوية من DAB-A و DAB-B (انظر جدول المواد) في أنبوب بحجم مناسب عن طريق توزيع نفس عدد القطرات من كل محلول. اصنع ~ 120 ميكرولتر من ركيزة DAB لكل قسم (~ 2 قطرات من كل كاشف / إجمالي 4). امزجها جيدا لمدة 3x-5x.
2. خذ كل شريحة ، واحدة تلو الأخرى ، من رف الشرائح واضغط و / أو قم بنقرها لإزالة السائل الزائد قبل وضعها في رف الشرائح.
3. الماصة ~ 120 ميكرولتر من DAB على كل قسم من الأنسجة. تأكد من تغطية الأقسام واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. تخلص من DAB المتبقي وفقا للوائح المحلية وأدخل الشريحة في رف منزلق مغمور في طبق تلطيخ مملوء بماء الصنبور.

< p class = "jove_title" >3. التلوين المضاد

1. انقل رف الانزلاق إلى طبق تلطيخ يحتوي على محلول تلطيخ هيماتوكسيلين بنسبة 50٪ واتركه يرتاح لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن الشرائح ستصبح أرجوانية.
2. انقل رف الشرائح على الفور مرة أخرى إلى طبق تلطيخ يحتوي على ماء الصنبور واغسل الشرائح 3x-5x عن طريق تحريك الرف لأعلى ولأسفل.
3. استمر في تكرار خطوة الغسيل بماء الصنبور العذب حتى تصبح الشرائح صافية بينما تظل الأقسام أرجوانية.
4. استبدل ماء الصنبور في طبق التلوين بماء أمونيا بنسبة 0.02٪. حرك الحامل لأعلى ولأسفل 2x-3x. لاحظ أن قسم الأنسجة يجب أن يتحول إلى اللون الأزرق.
5. استبدل ماء الأمونيا بماء الصنبور. اغسل الشرائح 3x-5x.

< p class = "jove_title" >4. الجفاف

1. انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ يحتوي على 70٪ إيثانول في غطاء الدخان واتركه يرتاح لمدة دقيقتين مع التحريك العرضي.
2. انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ أول يحتوي على 100٪ إيثانول واتركه يرتاح لمدة دقيقتين مع التحريك العرضي.
3. انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ ثان يحتوي على 100٪ من الإيثانول واتركه يرتاح لمدة دقيقتين مع التحريك العرضي.
4. انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ يحتوي على الزيلين واتركه يرتاح لمدة 5 دقائق مع التحريك العرضي.

فئة < p = "jove_title" >5. تركيب الشريحة

1. قم بإزالة الشرائح من رف الشرائح وضعها بشكل مسطح ، بحيث تكون الأقسام متجهة لأعلى في غطاء الدخان.
2. قم بتركيب شريحة واحدة في كل مرة عن طريق إضافة قطرة واحدة من وسيط التثبيت القائم على الزيلين إلى كل شريحة ووضع غطاء مقاس 24 مم × 50 مم بعناية فوق القسم. تجنب حبس أي فقاعات هواء.
3. جفف الشرائح بالهواء لمدة ≥5 دقائق.

< p class = "jove_title" >6. تقييم العينة

1. افحص أقسام الأنسجة تحت مجهر المجال الساطع القياسي بتكبير 20x-40x.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول الهيماتوكسيلين ، الخياشوم رقم 1 ميرك جي إتش إس 132 RNAscope 2.5 كواشف الكشف عالي الدقة - براون شركة تشخيص الخلايا المتقدمة هاتف: 322310 تتضمن هذه المجموعة كواشف التضخيم AMP1 و AMP2 و AMP3 و AMP4 و AMP5 و AMP6 وكواشف الكشف DAB-A و DAB-B مسبار RNAscope - HPV16 / 18 شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 311121 رف منزلق HybEZ شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 300104 ImmEdge قلم حاجز مسعور شركة تشخيص الخلايا المتقدمة 310018