< p class = "jove_title" >
1. تحضير الكواشف المضادة للتلطيخ
- تحضير 50٪ هيماتوكسيلين.
- في غطاء الدخان ، أضف 100 مل من هيماتوكسيلين جيل الأول (انظر جدول المواد) إلى 100 مل من الماء المقطر في طبق تلطيخ.
ملاحظه: يمكن إعادة استخدام محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين بنسبة 50٪ لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
- تحضير 0.02٪ (وزن / حجم) ماء الأمونيا (كاشف أزرق).
- في غطاء الدخان ، أضف 1.43 مل من هيدروكسيد الأمونيوم 1 نيوتن إلى 250 مل من الماء المقطر في أسطوانة متدرجة أو حاوية أخرى. ختم الاسطوانة بغشاء البارافين. امزج محتوياته جيدا لمدة 3x-5x.
ملاحظه: لقياس كمية الفحص ، من الأهمية بمكان استخدام هيدروكسيد الأمونيوم. يمكن تحضير الكواشف في وقت مبكر. تأكد من بقاء جميع الحاويات مغطاة.
< p class = "jove_title" >
2. كشف الإشارة باستخدام 3،3'-diaminobenzidine
< p class = "jove_content" >
تنبيه: ديامينوبنزيدين (DAB) سام. اتبع الاحتياطات المناسبة وإرشادات السلامة عند التخلص من هذه المادة الكيميائية والتعامل معها.
- امزج كميات متساوية من DAB-A و DAB-B (انظر جدول المواد) في أنبوب بحجم مناسب عن طريق توزيع نفس عدد القطرات من كل محلول. اصنع ~ 120 ميكرولتر من ركيزة DAB لكل قسم (~ 2 قطرات من كل كاشف / إجمالي 4). امزجها جيدا لمدة 3x-5x.
- خذ كل شريحة ، واحدة تلو الأخرى ، من رف الشرائح واضغط و / أو قم بنقرها لإزالة السائل الزائد قبل وضعها في رف الشرائح.
- الماصة ~ 120 ميكرولتر من DAB على كل قسم من الأنسجة. تأكد من تغطية الأقسام واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- تخلص من DAB المتبقي وفقا للوائح المحلية وأدخل الشريحة في رف منزلق مغمور في طبق تلطيخ مملوء بماء الصنبور.
< p class = "jove_title" >
3. التلوين المضاد
- انقل رف الانزلاق إلى طبق تلطيخ يحتوي على محلول تلطيخ هيماتوكسيلين بنسبة 50٪ واتركه يرتاح لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن الشرائح ستصبح أرجوانية.
- انقل رف الشرائح على الفور مرة أخرى إلى طبق تلطيخ يحتوي على ماء الصنبور واغسل الشرائح 3x-5x عن طريق تحريك الرف لأعلى ولأسفل.
- استمر في تكرار خطوة الغسيل بماء الصنبور العذب حتى تصبح الشرائح صافية بينما تظل الأقسام أرجوانية.
- استبدل ماء الصنبور في طبق التلوين بماء أمونيا بنسبة 0.02٪. حرك الحامل لأعلى ولأسفل 2x-3x. لاحظ أن قسم الأنسجة يجب أن يتحول إلى اللون الأزرق.
- استبدل ماء الأمونيا بماء الصنبور. اغسل الشرائح 3x-5x.
< p class = "jove_title" >
4. الجفاف
- انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ يحتوي على 70٪ إيثانول في غطاء الدخان واتركه يرتاح لمدة دقيقتين مع التحريك العرضي.
- انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ أول يحتوي على 100٪ إيثانول واتركه يرتاح لمدة دقيقتين مع التحريك العرضي.
- انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ ثان يحتوي على 100٪ من الإيثانول واتركه يرتاح لمدة دقيقتين مع التحريك العرضي.
- انقل رف الشرائح إلى طبق تلطيخ يحتوي على الزيلين واتركه يرتاح لمدة 5 دقائق مع التحريك العرضي.
فئة < p = "jove_title" >
5. تركيب الشريحة
- قم بإزالة الشرائح من رف الشرائح وضعها بشكل مسطح ، بحيث تكون الأقسام متجهة لأعلى في غطاء الدخان.
- قم بتركيب شريحة واحدة في كل مرة عن طريق إضافة قطرة واحدة من وسيط التثبيت القائم على الزيلين إلى كل شريحة ووضع غطاء مقاس 24 مم × 50 مم بعناية فوق القسم. تجنب حبس أي فقاعات هواء.
- جفف الشرائح بالهواء لمدة ≥5 دقائق.
< p class = "jove_title" >
6. تقييم العينة
- افحص أقسام الأنسجة تحت مجهر المجال الساطع القياسي بتكبير 20x-40x.