حصاد DRG من العمود الفقري للفئران: إجراء لاستخراج العقدة الجذرية الظهرية من العمود الفقري لنموذج الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Schmidt ، L. B. et al. الغشاء المشيمي في الجسم الحي لتقييم الغزو المحيط بالعصب في سرطان الرأس والرقبة. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح استخراج عقدة الجذر الظهري أو DRG من العمود الفقري للفئران المحصودة للتطبيقات النهائية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. حصاد وتحضير DRGs (التوقيت المقدر: 2 ساعة ، اليوم 8)

ملاحظة: تتطلب التجارب على الفئران والجرذان موافقة IACUC. في بعض البلدان ، يتطلب استخدام بيض الدجاج أيضا الموافقة.

1. احصل على فئران Sprague Dawley البالغة من العمر ستة إلى سبعة أسابيع (~ 200 جرام في الوزن) لاستخراج DRGs.
   ملاحظه: يجب أن ينتج فأر واحد ~ 40 DRGs لعنق الرحم والصدر. ومع ذلك ، يجب تحسين ظروف هذا النوع بشكل مستقل.
2. في خزانة التدفق الصفحي ، قم بحصاد DRGs من مناطق عنق الرحم والصدر باتباع بروتوكول استخراج DRG للفأر المنشور في مكان آخر. اتبع الشكل 1 للحصول على إرشادات حول كيفية حصاد DRGs.
   1. القتل الرحيم للجرذ عن طريق ثقب القلب بعد إعطاء الكيتامين / الزيلازين المحقون داخل الصفاق. نظف جلد الفئران بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بإزالة العمود الفقري للفئران باستخدام مقص. لا تقم بخلع عنق الرحم لأن هذا قد يضر ب DRGs عنق الرحم.
   2. افصل بين مناطق عنق الرحم والصدر وأسفل الظهر بنفس المقص ، باتباع التمثيل التشريحي التخطيطي والصور الإجمالية الواردة في الشكل 1A-D. ضع أقسام العمود الفقري في طبق ثقافة مقاس 10 سم مع 1X PBS للحفاظ على الأنسجة رطبة.
   3. باستخدام مقص عظمي دقيق ، افتح عظام العمود الفقري في الجوانب الظهرية والبطنية ، وافصل العمود الفقري إلى نصفين جانبيين (الشكل 1E-F). ضع أقسام الأنسجة في طبق نظيف مقاس 10 سم مع 1X PBS الطازج.
   4. باستخدام الملقط ، افصل الحبل الشوكي برفق عن عظام العمود الفقري لتصور DRGs (الشكل 1G).
   5. باستخدام ملقط دقيق مثبت أسفل كل DRG ، أمسكها واسحبها للخارج من تجويف العظام الذي توجد فيه. لا تمسك DRG مباشرة لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الأنسجة. لا تقم بقص حزم المحاور العصبي من DRG (الشكل 1H). < / > ملاحظه: تجنب استخدام DRGs القطنية لأنها قللت من التكامل في CAM. بالنسبة لموقع منطقة DRG ، اتبع الرسم التخطيطي والصور التشريحية الإجمالية في الشكل 1A-D.
3. مباشرة بعد الحصاد ، ضع كل DRG في وسط استزراع DMEM مع 2٪ بنسلين / ستربتومايسين (قلم / بكتيريا) و 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) للمساعدة في منع التلوث البكتيري ل DRGs. قم بتجميع جميع DRGs في نفس طبق الاستزراع 6 سم مع 4 مل من وسط الاستزراع.
4. بعد حصاد جميع DRGs ، انقلها إلى طبق استزراع جديد مع وسط استزراع DMEM مكمل بنسبة 2٪ Pen / Strep بالإضافة إلى 10٪ FBS ويحتوي على 1.25 ميكروغرام / مل من صبغة الفلورسنت الحمراء. احتضان لمدة 1 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا.

النتائج

الشكل 1: استخراج DRG في اليوم 8. أ. تخطيطي للجرذ يوضح الموقع التشريحي للعمود الفقري. ب. رسم تخطيطي لتكوين فقرات الفئران يوضح مناطق مختلفة من الجسم ؛ أخضر لعنق الرحم ، والأزرق الداكن للصدر ، والبرتقالي لأسفل الظهر والأزرق الفاتح للفقرات العجزية. C-D. الجانب البطني للفقر الفقري للفئران بعد الاستئصال الجراحي; الفصل بين المناطق كما هو موضح في...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات PBS (1x) الرقم الهيدروجيني 7.4 جيبكو # 10010-023 محلول ملحي مخزن بالفوسفات فئران سبراج داولي (إناث) مختبرات نهر تشارلز رمز السلالة: 001 6-7 أسابيع (190-210 جرام في الوزن) ملقط دومون # 5 ناعم أدوات العلوم الدقيقة (FST) # 11254-20 تستخدم لحصاد DRG ملقط Graefe ناعم للغاية ، منحني أدوات العلوم الدقيقة (FST) # 11151-10 تستخدم لتطعيم DRG على CAM في اليوم 8 ولحصاد أنسجة CAM في اليوم 17 ملقط Graefe ناعم للغاية ، مستقيم أدوات العلوم الدقيقة (FST) # 11150-10 تستخدم لتطعيم DRG على CAM في اليوم 8 ولحصاد أنسجة CAM في اليوم 17 DMEM (1x) جيبكو # 11965-092 Dulbeecco's النسر المعدل المتوسط صبغة الفلورسنت CellTracker الحمراء CMTPX تقنيات الحياة # C34552 أعد تكوين 50 ميكروغرام في 40 ميكرولتر من DMSO ومخزونها عند -20 درجة مئوية. استخدم 1 ميكرولتر من محلول المخزون / مل من وسط الاستزراع القلم / البكتيريا العقدية جيبكو # 15140-122 10,000 وحدة / مل بنيسيلين ، 10,000 ميكروغرام / مل ستربتومايسين مرحبا FBS جيبكو # 10082-147 مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة DMSO كواشف فيشر الحيوية # BP231-100 ثنائي ميثيل سلفوكسيد