غشاء المشيمة أو نموذج ورم CAM: طريقة في البيض لمحاكاة الغزو حول العصب للخلايا السرطانية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Schmidt ، L. B. et al. الغشاء المشيمي في الجسم الحي لتقييم الغزو المحيط بالعصب في سرطان الرأس والرقبة. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة الزراعة المشتركة للعقد الجذرية الظهرية والخلايا السرطانية على غشاء المشيمة أو CAM لدراسة الغزو حول العصب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تطعيم DRG على CAM (التوقيت المقدر: 40 دقيقة ، اليوم 8)

1. قم بإعداد طبق ثقافة 6 سم مع وسط HBSS لغسل DRGs قبل الزرع. أحضر البيض المحضر إلى خزانة التدفق الصفحي لثقافة الخلية. قم بإزالة غشاء البارافين من البيضة (الشكل 1 أ).
2. باستخدام ملقط معقم ناعم ، أمسك DRG برفق من داخل وسط الاستزراع. اغمسها في وسط HBSS لإزالة الوسط الزائد الذي يحتوي على صبغة الفلورسنت. امسك DRG برفق شديد ؛ خلاف ذلك ، سوف تلتصق بالملقط.
3. ضع DRG على CAM ، مع الحرص على عدم ثقب الغشاء (الشكل 1B-C). إذا لزم الأمر ، استخدم زوجا آخر من الملقط للمساعدة في فصل DRG عن طرف الملقط عند وضعه على CAM.
   ملاحظه: سيؤدي الحفاظ على DRG رطبا باستخدام وسيط HBSS أيضا إلى تسهيل الانفصال عن الملقط.
4. غطي البيضة بصلصة شفافة معقمة. قم بتغطية جميع النوافذ والثقوب المصنوعة في قشر البيض لتجنب التلوث البكتيري (الشكل 1 د).
5. بعد تطعيم DRGs في جميع البيض ، احتضان البيض في حاضنة ترطيب عند 38 درجة مئوية و 54٪ رطوبة لمدة يومين ، دون دوران.

< ص الفئة = "jove_title">2. تطعيم الخلايا السرطانية على CAM (التوقيت المقدر: 1 ساعة و 30 دقيقة ، اليوم 10)

1. في 48 ساعة قبل تطعيم الخلايا ، قم بوضع الخلايا اللازمة في ألواح الاستزراع. احسب 0.5 إلى 1 × 10⁶ خلايا لكل بويضة لخلايا UM-SCC-1 من أجل توليد أورام ثلاثية الأبعاد في CAM. اعلم أن رقم الخلية قد يختلف حسب خط الخلية.
2. وسط الشفط وإضافة وسط ثقافة DMEM مع 1٪ قلم / بكتيريا العقدية بالإضافة إلى 10٪ FBS و 2.5 ميكروغرام / مل من صبغة الفلورسنت الخضراء. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الخلايا. بعد ذلك ، تحقق من شدة التألق على المجهر ، وشفط الوسط ، واغسلها مرة واحدة باستخدام 1X PBS ، وأضف 0.25٪ تريبسين لمدة تصل إلى 10 دقائق. تحييد التربسين مع وسيط مكمل DMEM.
3. جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 4 دقائق لتشكيل حبيبات خلية. قم بشفط وسط DMEM وإعادة تعليقه في HBSS لغسل صبغة الفلورسنت الزائدة. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
4. أحضر البيض إلى خزانة التدفق الصفحي لثقافة الخلية. باستخدام المقص والملقط ، افتح ضمادة الفيلم الشفافة التي تغطي البيضة (الشكل 1E-F).
5. الطرد المركزي العدد المحسوب للخلايا مرة أخرى ، واستنشق وسط HBSS ، وإعادة تعليقه عند تركيز نهائي من 0.5 إلى 1 × 10⁶ خلايا لكل 5 ميكرولتر من نفس الوسط (الشكل 1G). تحضير الكمية اللازمة لإجمالي عدد البيض (5 ميكرولتر من معلق الخلية لكل بيضة).
6. ضع 5 ميكرولتر من محلول الخلية على CAM ، على بعد حوالي 2 مم من DRG (الشكل 1H). حافظ على مسافات موحدة بين DRG والخلايا. احرص على عدم إزعاج البويضة لتقليل انتشار الخلايا. < / > ملاحظه: لبدء زرع الخلايا ، اختر البويضات التي يكون سطح CAM جافا بصريا عليها. إذا كان السطح رطبا جدا ، يمكن أن تنتشر الخلايا ولا تشكل أورام منتظمة.
7. غطي البيضة بصلصة فيلم جديدة كما في الخطوة 1.4. تطعيم الخلايا في جميع البويضات. احتضن البيض في حاضنة ترطيب عند 38 درجة مئوية ورطوبة 54٪ لمدة 7 أيام ، دون دوران.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تطعيم DRG والخلايا وحصاد CAM: في اليوم 8: أ. يمكن ملاحظة CAM بسهولة بعد إزالة غشاء شمع البارافين. BC. باستخدام ملقط دقيق ، يتم وضع DRG على CAM. د. البيض مغطى بصلصة الفيلم ويوضع في الحاضنة. تشير الأسهم إلى الفتحات التي يتم تغطيتها. في اليوم 10: E-F. تتم إزالة ضمادة الفيلم ويقع DRG (رأس السهم على F).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حاضنة البيض GQF الرياضي الرقمي #1502 حاضنة بيض مجهزة بتحكم في درجة الحرارة والرطوبة بالحرارة الرقمية ذات الدوران الأوتوماتيكي قاطع النقش دريميل #108 تستخدم لحفر قشرة البيضة ملقط Graefe ناعم للغاية ، منحني أدوات العلوم الدقيقة (FST) # 11151-10 تستخدم لتطعيم DRG في CAM في اليوم 8 وحصاد أنسجة CAMفي اليوم 17 ملقط Graefe ناعم للغاية ، مستقيم أدوات العلوم الدقيقة (FST) # 11150-10 تستخدم لتطعيم DRG على CAM في اليوم 8 ولحصاد أنسجة CAM في اليوم 17 بيض لومان الأبيض المخصب البويضات المخصبة في أيام الإخصاب المبكرة ويفضل أن يكون ذلك في اليوم الأول بعد الإخصاب. البيض المستخدم في هذا البروتوكول من مزرعة دواجن جامعة ولاية ميشيغان. ملقط التصفية EMD ميليبور #XX6200006P ملقط حاد يستخدم لإزالة قشرة البيضة HBSS (1x) جيبكو # 14025-092 محلول الملح المتوازن من هانك غشاء شمع البارافين فيلم مختبر بارافيلم #PM-996 تستخدم لتغطية فتحات البويضات مؤقتا حتى تطعيم DRG في اليوم 8 PBS (1x) الرقم الهيدروجيني 7.4 جيبكو # 10010-023 محلول ملحي مخزن بالفوسفات Tegaderm خلع الملابس الشفافة 3 م #9505W معقم ، 6 × 7 سم يستخدم لتغطية فتحات البيض أثناء الحضانة