نمذجة العلاج داخل الورم بمثبطات الحمض النووي الريبي: طريقة لتحليل تأثير مثبطات الحمض النووي الريبي المرسال على نمو الورم في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: Ramirez-Moya ، J. et al. في الجسم الحي تثبيط microRNA لتقليل نمو الورم في الفئران. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو التوصيل في الجسم الحي لمثبطات miRNA كعوامل علاجية ضد نمو الورم في نماذج الفئران التقويمية. يسمح الإعطاء داخل الورم لمثبطات miRNA الاصطناعية أو antagomiRs بربط وتثبيط miRNAs الداخلية ، مما يتسبب في تنظيم mRNA وقمع نمو الورم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تلقيح الجناح للخلايا وعلاج antagomiR داخل الورم

1. تحضير الخلية
   1. قم بهندسة خط خلايا سرطان الغدة الدرقية البشرية Cal62 (طفرات KRASG12R و p53A161D) للإفراط في التعبير عن بنية معدلة وراثيا تعبر بشكل أساسي عن GFP و luciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). حدد الخلايا المعدلة وراثيا عن طريق مقاومة المضادات الحيوية أو عن طريق فرز الخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام قياس التدفق الخلوي.
   2. قم بزراعة الخلايا في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco المكمل بالبنسلين والستربتومايسين ومصل الأبقار الجنيني 10٪ (FBS) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   3. قم بتعليق 1 × 10⁶ خلايا في 50 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) عند 4 درجات مئوية.
2. تلقيح الخلايا في أجنحة الفئران
   1. امزج الخلايا بنفس الكمية من مصفوفة الغشاء القاعدي. على سبيل المثال ، أضف 1 × 10⁶ خلايا في 50 ميكرولتر من PBS إلى 50 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد) واخلطها برفق.
   2. حقن 100 ميكرولتر من العينة (الخلايا في مصفوفة الغشاء القاعدي + PBS + القاعد) تحت الجلد في الجانب الأيسر لفئران BALB / c nu / nu التي تعاني من نقص المناعة البالغة من العمر 6 أسابيع باستخدام حقنة الأنسولين سعة 1 مل بإبرة 27G 1/2 '' (0.4x13 مم).
3. علاج antagomiR داخل الورم
   1. قم بتعليق antagomiR (انظر جدول المواد) أو التحكم السلبي في 500 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من RNase.
   2. قبل الحقن ، قم بإعداد 2 نانومول من antagomiR أو التحكم مع كاشف توصيل في الجسم الحي (انظر جدول المواد) لكل حقنة.
      1. قم أولا بخلط محلول antagomiR (انظر جدول المواد) والمخزن المؤقت للمعقد (انظر جدول المواد) بنسبة 1: 1. على سبيل المثال ، أضف 80 ميكرولتر من محلول مثبط miRNA (16 نانومول) إلى 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للمعقد (مدرج في مجموعة كاشف التوصيل في الجسم الحي ، انظر جدول المواد).
      2. أحضر كاشف التوصيل في الجسم الحي إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 160 ميكرولتر إلى أنبوب سعة 1.5 مل وأضف على الفور 160 ميكرولتر من محلول أنتاغومير المخفف. أعد الكاشف المتبقي إلى -20 درجة مئوية. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين الكاشف عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد الذوبان.
      3. دوامة على الفور (10 ثوان) لضمان تعقيد كاشف التوصيل في الجسم الحي - antagomiR.
      4. احتضان خليط كاشف التوصيل في الجسم الحي - antagomiR لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية.
      5. خفف المركب 6 أضعاف بإضافة 1360 ميكرولتر من PBS pH 7.4 واخلطه جيدا.
      6. استمر في توصيل مركب الكاشف أنتاغومير في الجسم الحي (8 فئران / حالة) أو قم بتخزين المركب عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الحقن. حقن 200 ميكرولتر داخل الورم في كل ورم (2 نانومول من أنتاغومير).
         ملاحظة: حجم وكمية antagomiR مستقلان عن حجم الورم.
   3. قم بإجراء العلاج 3 مرات كل أسبوع (الاثنين والأربعاء والجمعة) لمدة أسبوعين.
4. تحليل نمو الورم
   1. حقن 50 ميكرولتر من محلول 40 مجم / مل من ركيزة D-luciferin (انظر جدول المواد) تحت الجلد في كل نقطة زمنية باستخدام حقنة 1 مل بإبرة 27G 1/2 بوصة (0.4 مم × 13 مم).
      1. بعد 8 دقائق من الحقن ، قم بتخدير الفئران باستخدام 3٪ إيزوفلوران ممزوج بالأكسجين. تقييم مستوى التخدير عن طريق منعكس الدواسة (قرصة إصبع القدم الثابتة) وضبط توصيل التخدير حسب الاقتضاء للحفاظ على المستوى الجراحي.
      2. ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف.
5. قم بتصوير إشارة الإضاءة الحيوية باستخدام برنامج التصوير في الجسم الحي (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الفرجار لقياس حجم الورم ونمو الورم.
6. بمجرد الحصول على إشارات التلألؤ البيولوجي ، قم بتحليل نمو الورم مقارنة كلا العلاجين وتحديد الأهمية باستخدام اختبار t. لتحليل التباين داخل المجموعة ، استخدم SEM.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مصفوفة الغشاء القاعدي: مصفوفة غشاء القاعدة Matrigel تركيز عال كورنينج #354248 AntagomiR: مثبط mirVana miRNA ثيرمو فيشر 4464088 جاهز في الجسم الحي كاشف التسليم في الجسم الحي: كاشف Invivofectamine 3.0 ثيرمو فيشر التلقيح الاصطناعي 3005 التحكم السلبي: مثبط mirVana miRNA ، التحكم السلبي # 1 ثيرمو فيشر 4464077 جاهز في الجسم الحي XenoLight D-Luciferin - ركيزة الملح الحيوي K + بيركين إلمر 122799 مخفف في PBS برنامج التصوير في الجسم الحي: نظام التصوير IVISLumina II علوم الحياة الفرجار