تضمين الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد في قطرات هلام الاغاروز: تقنية للحفاظ على المركبات الكروية لتحليل المصب

الملخص

المصدر: Rolver ، M. G. et al. تقييم قابلية الخلية للحياة والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو تقنية تضمين الكرات الكروية ثلاثية الأبعاد في قطرات هلام الاغاروز للحفظ. يمكن استخدام الفرويات ثلاثية الأبعاد المدمجة بشكل أكبر لتحليل المصب.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تضمين الفرويات ثلاثية الأبعاد

1. تحضير جل الاغاروز الذي يتم تضمين الكرات فيه (ضروري فقط لأول مرة لتنفيذ البروتوكول)
   1. امزج 1 جم من باكتو أجار في 50 مل من ddH₂O.
   2. سخنيها ببطء في فرن الميكروويف حتى يذوب باكتو أجار ويتشكل هلام متجانس. لا تدع الجل يغلي.
   3. حافظ على الدفء في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
   4. يحفظ عند 4 درجات مئوية بين التجارب.
2. تضمين الكرويات
   1. في اليوم الأول ، لكل حالة ، قم بتجميع ما لا يقل عن 12 كرويا في أنبوب سعة 1.5 مل.
   2. يغسل مرة واحدة ب 1 مل من 1X PBS المثلج.
   3. لإصلاح الكرويات ، أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهايد .
      ملاحظه: يجب أن يتم التعامل مع بارافورمالدهايد في غطاء الدخان.
   4. دعهم يحتضنون لمدة 24 ساعة في RT.
   5. في اليوم 2 ، سخني جل الاغاروز بعناية عن طريق وضعه في دورق مملوء بالماء في فرن الميكروويف. تأكد من أن الجل لا يغلي. يحفظ دافئا على لوح تسخين على سطح الطاولة ، عند 60 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   6. اغسل الكرات الكروية مرتين ب 1 مل من 1X PBS المثلج.
   7. استنشق معظم 1X PBS (ترك ما يقرب من 100 ميكرولتر في هذه المرحلة عملي للتعامل مع الكرويات).
   8. قم بإعداد ماصة سعة 20 ميكرولتر عن طريق قطع طرف الماصة عند منحدر للحصول على طرف مدبب بفتحة أكبر (الشكل 1).
      ملاحظة: يجب أن يتم الجزء التالي بسرعة لضمان النقل الأمثل للفيرويات وتجنب تصلب قطرة الجل. في حالة عدم توفر كتلة تسخين ، يوصى أولا بالتقاط الكرويات ثم إسقاط الاغاروز (أي تبديل ترتيب النقطتين 1.2.9 و 1.2.10).
   9. اصنع قطرة جل الاغاروز على شريحة مجهرية. ضع الشريحة على كتلة تسخين دافئة لمنع الاغاروز من التصلب.
   10. باستخدام طرف الماصة المعدل (الخطوة 1.2.8) ، اصطاد أكبر عدد ممكن من المركبات الكروية بحجم يتراوح بين 15 و20 ميكرولتر.
   قم
   11. بحقن 15-20 ميكرولتر من 1X PBS المحتوي على الكروية بعناية في وسط قطرة هلام الاغاروز دون لمس شريحة المجهر.
       ملاحظه: هذه نقطة صعبة بعض الشيء. ستفقد الكرويات إذا لامس طرف الماصة شريحة المجهر عند حقن الكرات في قطرة الجل. ينصح بممارسة العملية الكاملة لصنع قطرة الاغاروز وحقن الكرويات عن طريق حقن سائل ملون في القطرة. سيسمح ذلك بتصور اختراق محتمل من خلال القطرة ، حيث سيتسرب السائل الملون إلى الشريحة.
   12. دع قطرة جل الاغاروز تتصلب عن طريق الحضانة لمدة 5-10 دقائق عند RT أو عند 4 درجات مئوية. بمجرد أن تصلب قطرة الجل إلى حد ما (لكنها لا تزال ناعمة إلى حد ما) ، ادفع قطرة الجل بعناية من شريحة المجهر إلى كاسيت مناديل بلاستيكية بمشرط.
   13. قم بتغطية أشرطة المناديل البلاستيكية بنسبة 70٪ من الإيثانول.
       ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام الكرويات مباشرة أو تخزينها لعدة أشهر.
   14. قم بتضمين الكروي المضمن في الاغاروز في البارافين ، وقم بتقسيمه إلى شرائح طبقة بسمك 2-3 ميكرومتر ، وصمة عار بالهيماتوكسيلين واليوزين أو عرضة للتلوين المناعي النسيجي.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التثبيت والتضمين وتحليل الكيمياء النسيجية المناعية للكرويات. (أ) التمثيل التخطيطي لبروتوكول تضمين الكرويات. يتم وضع علامة على الخطوات الفردية على أنها (i-vii). (ب) صورة كروية MDA-MB-231 الكروية. شريط المقياس: 50 ميكرومتر (C) صورة تمثيلية لكروية MDA-MB-231 المعالجة بالعلاج الكيميائي الخاضعة لتحليل IHC م...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات باكتوجار BD Bioscience # 214010 تستخدم لتحضير هلام الاغاروز فورمالدهيد كيماويات VWR # 9713.1000 تستخدم لتثبيت الخلايا كاسيت Medim Uni-safe Medim Histotechnologie 10-0114 تستخدم لتخزين المركبات الكروية المدمجة شريحة التصاق Superfrost Ultra-Plus Menzel-Gläser #J3800AMNZ شريحة زجاجية مجهرية تستخدم للتضمين اختبار جدوى الخلايا CellTiter-Glo 3D بروميجا #G9681 تستخدم لمقايسة صلاحية الخلية