مقالة منهجية

تصنيع مصفوفة خارج الخلية من نموذج الفأر: إجراء فعال لتحضير مصفوفة خارج الخلية منزوعة الخلايا من لسان الفئران

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Yao, Y. et al. تصنيع مصفوفة اللسان خارج الخلية وإعادة تكوين سرطان الخلايا الحرشفية في اللسان في المختبر. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تحضير مصفوفة لسان الفئران خارج الخلية باستخدام طريقة إزالة الخلايا ، والتي تتضمن تعريض اللسان المحصود لسلسلة من العلاجات الفيزيائية والكيميائية والأنزيمية. تحتفظ سقالة TEM الناتجة بتركيبة المصفوفة الأصلية خارج الخلية ، مما يزيل المكونات الخلوية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير مصفوفة اللسان خارج الخلية (TEM)

  1. إعدام الفئران عن طريق خلع عنق الرحم وإزالة الألسنة باستخدام مقص جراحي معقم وملاقط.
  2. اغمر الألسنة في 75٪ من الإيثانول لمدة 3 دقائق ، ثم ضع كل لسان في أنبوب Eppendorf (EP) سعة 1.5 مل مع 1 مل من محلول الفوسفات المعقم (PBS) سعة 10 مليمتر.
    ملاحظه: تركيز PBS في جميع الخطوات التالية هو نفس التركيز في هذه الخطوة.
  3. تحلل الخلايا عن طريق التجميد والذوبان: قم بتجميد الألسنة في أنابيب EP عند -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم قم بإذابة الألسنة في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة لمدة 3 دورات.
  4. قم بتحميل كل لسان على قطعة من الخيط الجراحي باستخدام إبرة جراحية ولف نهاية الخيط بقطعة صغيرة من ورق القصدير المعقم. قم بإجراء العملية في طبق استزراع مقاس 3.5 سم أو 6 سم يحتوي على 75٪ إيثانول في ظروف معقمة.
    ملاحظه: يبلغ الطول المناسب لكل قطعة من الخيط الجراحي حوالي 20 سم ، والحجم المناسب لكل قطعة من ورق القصدير حوالي 0.3 سم2 (1 سم × 0.3 سم). يجب تحميل اللسان بالقرب من ورق القصدير.
  5. اشطف كل لسان ب 3 مل من PBS المعقم في طبق مزرعة 3.5 سم أو 6 سم لمدة 30 ثانية. قم بإجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
  6. اغسل الألسنة بالماء فائق النقاء: أضف الأمبيسلين إلى زجاجة واسعة الفم تحتوي على 250 مل من الماء المعقم فائق النقاء بتركيز نهائي يبلغ 90 ميكروغرام / مل. ضع الألسنة في الزجاجة التي تحتوي على شريط تحريك. شد غطاء الزجاجة مع بقاء جزء من الخيط خارج الزجاجة. قم بإجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
    ملاحظه: يمكن وضع ما يصل إلى 5 ألسنة في نفس الزجاجة مع مراعاة توأمة الخياطة. يوجد ورق القصدير في نهاية الخيط في الزجاجة لمنع اللسان من الانزلاق. يجب وضع الألسنة بارتفاع 2 سم من قاع الزجاجة عن طريق ضبط طول الخيط المتبقي داخل الزجاجة. هذه الملاحظة مخصصة أيضا للخطوات 1.8 و 1.10 و 1.12 و 1.16.
  7. ضع الزجاجة على محرك مغناطيسي لمدة 12 ساعة.
  8. اغسل الألسنة بكلوريد الصوديوم: أضف الأمبيسلين إلى زجاجة واسعة الفم تحتوي على 250 مل من 1 M كلوريد الصوديوم المعقم إلى تركيز نهائي يبلغ 90 ميكروغرام / مل. حرك الألسنة وشريط التقليب في الزجاجة. شد غطاء الزجاجة مع بقاء جزء من الخيط خارج الزجاجة. قم بإجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
  9. ضع الزجاجة على محرك مغناطيسي لمدة 24 ساعة.
  10. تحلل الخلايا بواسطة Triton X-100: أضف الأمبيسلين إلى التركيز النهائي البالغ 90 ميكروغرام / مل في زجاجة واسعة الفم مع 250 مل من Triton X-100 المعقم 2٪ في PBS. حرك الألسنة وشريط التقليب في الزجاجة. شد غطاء الزجاجة مع بقاء جزء من الخيط خارج الزجاجة. قم بإجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
  11. ضع الزجاجة على محرك مغناطيسي لمدة 48 ساعة.
  12. اغسل الألسنة بكلوريدالكالسيوم 2 / ملجمغكلوريد 2: أضف الأمبيسلين إلى زجاجة واسعة الفم تحتوي على 250 مل من الكالسيوم المعقم 5 مليCaCl 2 / MgCl2 إلى تركيز نهائي قدره 90 ميكروغرام / مل. حرك الألسنة وشريط التقليب في الزجاجة. شد غطاء الزجاجة مع بقاء جزء من الخيط خارج الزجاجة. قم بإجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
  13. ضع الزجاجة على محرك مغناطيسي لمدة 24 ساعة.
  14. الهضم بواسطة DNase: أضف 1 مل من محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) إلى كل أنبوب EP. أضف DNase إلى HBSS على التوالي إلى تركيز نهائي يبلغ 300 ميكرومتر. حرك كل لسان إلى كل أنبوب EP ، مع جزء من الخيط خارج الأنبوب. قم بإجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
    ملاحظه: تأكد من أن جزء الخيط المتبقي داخل الزجاجات في الخطوات السابقة يبقى أيضا داخل أنبوب EP في هذه الخطوة ، وتأكد من أن جزء الخيط الذي يبقى خارج الزجاجات في الخطوات السابقة أيضا خارج أنبوب EP في هذه الخطوة.
  15. احتضان الألسنة في أنابيب EP عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  16. اغسل الألسنة باستخدام PBS: أضف الأمبيسلين في زجاجة واسعة الفم تحتوي على 250 مل من PBS المعقم إلى تركيز نهائي يبلغ 90 ميكروغرام / مل. حرك الألسنة وشريط التقليب في الزجاجة. شد غطاء الزجاجة مع بقاء جزء من الخيط خارج الزجاجة. قم بإجراء هذه العملية في ظروف معقمة.
  17. ضع الزجاجة على محرك مغناطيسي لمدة 24 ساعة.
  18. قم بتخزين TEM المحضر في PBS معقم عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الفئران C57-BL / 6J مركز مختبر جامعة صن يات صن ايثانول مصنع الكاشف الكيميائي في قوانغتشو HB15-GR-2.5L كلوريد الصوديوم سانغون للتكنولوجيا الحيوية A501218 فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة مصنع الكاشف الكيميائي في قوانغتشو بي 14-GR-500 جم فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة سانغون للتكنولوجيا الحيوية A501211 1.5 مل أنبوب EP أكسايجن MCT-150-أ فريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية ثيرمو فيشر العلمي طبق زراعة الخلايا 3.5 سم ثيرمو فيشر العلمي 153066 طبق ثقافة الخلايا 6 سم غرينر 628160 تريتون X-100 سيجما ألدريتش V900502 كلوريد الكالسيوم سيجما ألدريتش 746495 كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش 449164 DNase سيجما ألدريتش د5025 أمبيسلين سيجما ألدريتش أ 9393 خياطة جراحية شنغهاي جينهوان زجاجة 250 مل واسعة الفم شونيو 1407 النمام المغناطيسي كواحد 1-4602-32 حاضنة ثاني أكسيد الكربون مختبر شيل SCO5A جهاز تنقية المياه إلغا حمض الهيب الخالي بي بي آي A600264 ثلاجة 4 درجة مئوية هاير

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Triton X 100 PBS

مقالات ذات صلة