مقالة منهجية

الطحن بالتبريد للأنسجة منزوعة الخلايا: تقنية للحصول على مسحوق مصفوفة ناعم خارج الخلية

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kornmuller, A. et al. تصنيع الرغاوي والناقلات الدقيقة المشتقة من المصفوفة خارج الخلية كثقافة الخلايا الخاصة بالأنسجة. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، نقدم البروتوكول للحصول على مسحوق مصفوفة خارج الخلية المطحون بدقة من الأنسجة المجففة بالتجميد عن طريق الطحن بالتبريد. يحتفظ مسحوق ECM بتركيبته الكيميائية الحيوية ويمكن استخدامه لتخليق الناقل الدقيق.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. معالجة الأنسجة منزوعة الخلايا

  1. إزالة الخلايا والتجميد
    1. إزالة الخلايا من الأنسجة (الأنسجة) ذات الأهمية باتباع بروتوكول معمول به.
      ملاحظه: تم إعداد السقالات في الدراسة الحالية باتباع بروتوكولات إزالة الخلايا المنشورة ل DAT البشري و DDT الخنازير و DLV الخنازير. يمكن أيضا استخدام الكولاجين غير القابل للذوبان المتاح تجاريا لتصنيع الرغوة والناقلات الدقيقة ، مثل الكولاجين الذي يتم الحصول عليه من الأوتار البقرية ، والذي تم استخدامه بنجاح على نطاق تركيز يتراوح بين 10 و 50 مجم / مل. يمكن استخدام مصادر الكولاجين الأخرى غير القابلة للذوبان ولكنها قد تتطلب تحسينا لتحديد نطاق التركيز الذي سينتج عنه سقالات مستقرة.
    2. انقل الأنسجة الرطبة منزوعة الخلايا أو الكولاجين المنقى إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام ملقط وأضف كمية كافية من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) لغمر الأنسجة ، إلى أقصى حجم إجمالي يبلغ 35 مل.
    3. قم بتجميد العينة طوال الليل عند -80 درجة مئوية ، مع وضع أنبوب الطرد المركزي أفقيا أثناء التجميد لزيادة مساحة السطح للتسامي أثناء التجميد اللاحق.
    4. قم بإزالة الغطاء من أنبوب الطرد المركزي وانقل العينة المجمدة إلى وعاء تجفيد بالتجميد.
    5. قم بتجميد العينة باستخدام مجفف تجميد مختبري لمدة 48-72 ساعة أو حتى تجف بالكامل.
      ملاحظه: قد يختلف وقت التجفيف باختلاف المجففات والأنسجة منزوعة الخلايا.
    6. قم بفرم ECM المجفف بالتجميد إلى قطع صغيرة (~ 1-2 مم3) باستخدام مقص جراحي حاد.
    7. قم بتخزين ECM المفروم في مجفف حتى يصبح جاهزا لمزيد من المعالجة.
      ملاحظه: يوصى باستخدام ECM المفروم على الفور لمنع امتصاص الرطوبة من البيئة.
  2. الطحن بالتبريد (اختياري لتصنيع الرغوة)
    1. املأ غرفة طحن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 25 مل لنظام مطحنة كروية للمختبر باستخدام ECM مجفف بالتجميد المفروم وأضف كرتين من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 10 مم.
    2. أغلق غرفة الطحن المحملة واغمرها بالكامل في النيتروجين السائل لمدة 3 دقائق.
    3. قم بطحن العينة المجمدة لمدة 3 دقائق عند 30 هرتز (1,800 دورة في الدقيقة).
    4. كرر الخطوتين 1.2.2 و 1.2.3 حتى يتم طحن ECM إلى مسحوق ناعم.
      ملاحظه: قد يختلف عدد المرات التي يجب فيها تكرار هذه الخطوات بين مصادر ECM. على سبيل المثال ، يتطلب DAT عادة 3 دورات طحن لتوليد مسحوق ناعم.
    5. انقل المسحوق باستخدام مغرفة إلى قارورة زجاجية ، وأغلقها بإحكام ، واحفظها في مجفف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خيوط مشبك التمساح VWR هاتف: 470149-728 رقائق الألومنيوم فيشر ساينتيك 01-213-101 الميزان التحليلي سارتوريوس CPA225D نظام الطحن بالتبريد ريتش 20.745.0001 مم 400 ديسيكاتير فيشر ساينتيك 8624426 لتخزين ECM المجفف بالتجميد والسقالات الحيوية قارورة ديوار فيشر ساينتيك 10-196-6 شكل منخفض ؛ نطاق حجم 250 - 500 مل الماء المقطر المزدوج (ddH2O) من نظام تنقية المياه Barnstead GenPure xCAD ECM (المصفوفة خارج الخلية) معزولة عن الأنسجة الدهنية البشرية ، أدمة الخنازير أو عضلة القلب الخنازير ، كما هو موضح في Flynn et al. 2010 ، Reing et al. 2010 ، و Wainwright et al. 2010 ملقط VWR 37-501-32 لنقل الرغوة فريزر (-20 درجة مئوية) VWR 97043-346 فريزر (-80 درجة مئوية) الترمو: العلمية EXF40086A قوارير زجاجية فيشر ساينتيك 03-339-26 د لتخزين ECM المجفف بالتجميد النيتروجين السائل للرش الكهربائي مجفف التقويم لابكونكو 7750021 المنطقة الحرة4.5 غرفة الطحن ريتش 02.462.0213 يوصى بحجم 25 مل كرات الطحن VWR 16003-606 قطر 10 مم ، يوصى باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ البنسلين - ستربتومايسين تقنيات الحياة 15140-122 تستخدم لوسائط الانتشار Pipet-Aid XP ماندل ساینتفيك درو-4-000-101 سكوبولا VWR 89259-968 لجمع الناقلات الصغيرة مقص جراحي VWR 82027-590

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة