تحضير تعليق ECM: تقنية للحصول على تعليق متجانس من المصفوفة خارج الخلية المشتقة من الأنسجة

الملخص

المصدر: Kornmuller، A. et al. تصنيع الرغاوي والناقلات الدقيقة المشتقة من المصفوفة خارج الخلية كثقافة الخلايا الخاصة بالأنسجة. J. Vis. إكسب. (2017)

يصف هذا الفيديو تحضير معلق مصفوفة خارج الخلية متجانس وهضوم من الأنسجة منزوعة الخلايا والمجففة. تساعد هذه التقنية في تصنيع الرغوة المسامية المشتقة من ECM والناقلات الدقيقة لاستخدامها كركائز في نماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المتقدمة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. معالجة الأنسجة منزوعة الخلايا

1. إزالة الخلايا والتجميد
   1. إزالة الخلايا من الأنسجة (الأنسجة) ذات الأهمية باتباع بروتوكول معمول به.
      ملاحظه: تم إعداد السقالات في الدراسة الحالية باتباع بروتوكولات إزالة الخلايا المنشورة للأنسجة الدهنية البشرية منزوعة الخلايا (DAT) ، والأنسجة الجلدية منزوعة الخلايا من الخنازير (DDT) ، والبطين الأيسر منزوع الخلايا (DLV). يمكن أيضا استخدام الكولاجين غير القابل للذوبان المتاح تجاريا لتصنيع الرغوة والناقلات الدقيقة ، مثل الكولاجين الذي يتم الحصول عليه من الأوتار البقرية ، والذي تم استخدامه بنجاح على نطاق تركيز يتراوح بين 10 و 50 مجم / مل. يمكن استخدام مصادر الكولاجين الأخرى غير القابلة للذوبان ولكنها قد تتطلب تحسينا لتحديد نطاق التركيز الذي سينتج عنه سقالات مستقرة.
   2. انقل الأنسجة الرطبة منزوعة الخلايا أو الكولاجين المنقى إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام ملقط وأضف كمية كافية من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) لغمر الأنسجة ، إلى أقصى حجم إجمالي يبلغ 35 مل.
   3. قم بتجميد العينة طوال الليل عند -80 درجة مئوية ، مع وضع أنبوب الطرد المركزي أفقيا أثناء التجميد لزيادة مساحة السطح للتسامي أثناء التجميد اللاحق.
   4. قم بإزالة الغطاء من أنبوب الطرد المركزي وانقل العينة المجمدة إلى وعاء تجفيد بالتجميد.
   5. قم بتجميد العينة باستخدام مجفف تجميد مختبري لمدة 48-72 ساعة أو حتى تجف بالكامل.
      ملاحظه: قد يختلف وقت التجفيف باختلاف المجففات والأنسجة منزوعة الخلايا.
   6. قم بفرم ECM المجفف بالتجميد إلى قطع صغيرة (~ 1-2 مم³) باستخدام مقص جراحي حاد.
   7. قم بتخزين ECM المفروم في مجفف حتى يصبح جاهزا لمزيد من المعالجة.
      ملاحظه: يوصى باستخدام ECM المفروم على الفور لمنع امتصاص الرطوبة من البيئة.
2. الطحن بالتبريد
   1. املأ غرفة طحن من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 25 مل لنظام مطحنة كروية للمختبر باستخدام ECM مجفف بالتجميد المفروم وأضف كرتين من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 10 مم.
   2. أغلق غرفة الطحن المحملة واغمرها بالكامل في النيتروجين السائل لمدة 3 دقائق.
   3. قم بطحن العينة المجمدة لمدة 3 دقائق عند 30 هرتز (1,800 دورة في الدقيقة) في مسحوق ناعم.
      ملاحظه: قد يختلف عدد المرات التي يجب فيها تكرار هذه الخطوات بين مصادر ECM. على سبيل المثال ، يتطلب DAT عادة 3 دورات طحن لتوليد مسحوق ناعم.
3. إعداد تعليق ECM
   1. قم بوزن 250 مجم من ECM المفروم (للرغوة) أو المطحون بالتبريد (للرغاوي أو الناقلات الدقيقة) وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. راجع الخطوتين 1.1.6 والقسم 1.2 لتحضير ECM المفروم و ECM المطحون بالتبريد ، على التوالي.
      ملاحظه: تم تصميم هذا البروتوكول لإعداد معلق ECM بسعة 50 مجم / مل ، والذي يوصى به ل DAT البشري و DDT الخنازير و DLV الخنازير. اعتمادا على مصدر ECM المحدد ، يمكن إنشاء معلقات موحدة بتركيزات بدء أعلى أو أقل.
   2. أضف 5 مل من المخزن المؤقت 0.22 M NaH₂PO₄ (درجة الحموضة 5.4) إلى أنبوب الطرد المركزي وحدد مستوى السائل على الأنبوب.
   3. تحضير محلول مخزون α-أميليز بإضافة 7.5 مجم من α-أميليز إلى 1 مل 0.22 مولار هيدروهيدروكسيد_{الصوديوم 2}PO₄ (درجة الحموضة 5.4). أضف 100 ميكرولتر من محلول مخزون α-الأميليز (0.75 مجم من α-الأميليز: 0.3٪ وزن / وزن من الأنسجة الجافة) إلى العينة. أضف 0.22 M NaH₂PO₄ للحصول على حجم نهائي قدره 10 مل.
   4. قم بتحريك التعليق بشكل مستمر عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   5. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق المادة المحببة في 10 مل من 5٪ كلوريد الصوديوم المخفف في ddH₂O.
   6. كرر الخطوة 1.3.5 ليصبح المجموع مرتين بمحلول 5٪ كلوريد الصوديوم في ddH₂O.
   7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق المادة المحببة في 10 مل من ddH₂O.
   8. حرك التعليق بشكل مستمر عند 300 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند RT.
   9. جهاز الطرد المركزي للتعليق عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق.
   10. أضف 0.2 M من حمض الأسيتيك إلى علامة 5 مل التي تم إجراؤها في الخطوة 1.3.2.
   11. قم بتحريك التعليق بشكل مستمر عند 120 دورة في الدقيقة O / N عند 37 درجة مئوية.
   12. قم بتجانس نظام التعليق ECM في درجة حرارة الغرفة على فترات مدتها 10 ثوان باستخدام أداة تجانس يدوية مزودة بمسبار بعرض 10 مم حتى تختفي شظايا مرئية. ضع المعلق في دورق من الماء البارد بين فترات التجانس لمنع ارتفاع درجة الحرارة.
       ملاحظه: اعتمادا على مصدر ECM ، قد تكون هناك حاجة إلى مزيد من التخفيف في حمض الأسيتيك 0.2 M للحصول على تعليق متجانس. قد يؤدي التبريد المفرط لتعليق ECM إلى زيادة اللزوجة التي يمكن أن تتداخل مع التجانس الفعال. إذا لوحظت زيادة في اللزوجة ، فيمكن إعادة تسخين العينة إلى 37 درجة مئوية وإخضاعها لمزيد من المعالجة.
   13. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد قبل تصنيع الرغوة أو الناقل الصغير.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حمض الخليك الجليدي بيو شوب إيس 222.5 α الأميليز سيغما 101074694 من Aspergillus aryzae أجهزة الطرد المركزي 75004251 الترمو: العلمية مع دوار دلو متأرجح لأنابيب الطرد المركزي 15 و 50 مل أنابيب الطرد المركزي (15 مل) سارستيدت 62.554.205 ديسيكاتير فيشر ساينتيك 8624426 لتخزين ECM المجفف بالتجميد والسقالات الحيوية الماء المقطر المزدوج (ddH2O) من نظام تنقية المياه Barnstead GenPure xCAD ECM (المصفوفة خارج الخلية) معزولة من الأنسجة الدهنية البشرية أو أدمة الخنازير أو عضلة القلب الخنازير ، كما هو موضح في Flynn et al. 2010 ، Reing et al. 2010 ، و Wainwright et al. 2010 (المرجع # 28 ، 8 ، 32) الخالط باليد فيشر ساينتيك 14-359-251 السرعة: 8,000 - 30,000 دورة في الدقيقة ملحقات الخالط: رأى مجسات مولد أسفل الأسنان فيشر ساينتيك 14-261-17 10 × 95 ملم النيتروجين السائل كلوريد الصوديوم بيو شوب 7647-14-5 فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة بيو شوب 10049-21-5 مقص جراحي VWR 82027-590